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对香豆酸(p-Coumaric acid)具有保护心脏、利肝利胆、抗癌抗氧化等多种生物学功能,被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域,同时它也是芪氏化合物、黄酮类化合物等多种高价值化学品的合成前体。目前对香豆酸的生产主要依赖于低效、高耗能、高污染的植物提取或化学合成,这限制了对香豆酸的广泛应用。本文以微生物法生产对香豆酸为研究对象,通过大肠杆菌BL21(DE3)异源表达来源于粘红酵母(Rhodotorula glutinis)的酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia lyase,TAL)基因,使得细胞可以利用廉价、可再生的底物酪氨酸来合成对香豆酸;并采用随机突变、高通量筛选、酶分子理性改造相结合的技术对TAL进行综合改造,以提高对香豆酸的产量。具体研究结果如下:(1)将经密码子优化的R.glutinis tal基因克隆至表达载体p ETDuet-1,于大肠杆菌BL21(DE3)中实现异源表达。经硫酸铵分级沉淀、QFF阴离子交换层析、凝胶过滤层析获得电泳纯级别的TAL。酶学性质分析表明,TAL的最适反应p H为8.5,最适反应温度为40°C;比酶活达到1.78 U×mg-1;动力学参数K及kcat/Km值分别为0.382 mmol×L-1及298 L×mmol-1×s-1。为提高对香豆酸的产量,使用不同的表达质粒p ET-32a(+)、p ETDuet-1、p ET-28a(+)、p ACYCDuet-1、p RSFDuet-1及p CDFDuet-1优化TAL的表达。因载体p ET-32a(+)中的硫氧还蛋白促进了目的蛋白的可溶性表达,其重组菌获得了发酵24 h后最高的对香豆酸产量196.3 mg×L-1;(2)通过随机突变对TAL进行定向进化以提高TAL的活性,强化对香豆酸的合成。对随机突变流程及高通量筛选方法进行了优化:为控制突变频率及活性突变体的比例,以100 ng质粒为模板进行易错PCR反应(每50mL体系);为提高转化效率,选择p CDFDuet-1/tal为随机突变过程中的表达载体;为获得灵敏高效的检测效果,选择产物检测法为筛选方法。通过随机突变及高通量筛选,获得高产对香豆酸的突变体MT-1H11(S9N/A125V)、MT-5C4(E518V/S626C)及MT-1G9(A11T/S106C/N170D/M227T/D542G)。三者发酵生产对香豆酸的产量分别为231.5 mg×L-1、232.9 mg×L-1及238.4 mg×L-1,较野生型分别提高了37.1%、38.0%及41.2%;(3)对定向进化获得3个突变体所含的共9个突变位点分别进行定点突变。其中,突变体S9N、A11T及E518V分别获得了234.6 mg×L-1、212.5 mg×L-1及239.7 mg×L-1的对香豆酸产量,较野生型均提高了20.0%以上,其他6个单点突变体较野生型的变化不显著。S9N的突变影响了蛋白N端二级结构,从而使蛋白表达量及表观酶活提升。A11T及E518V的比酶活及催化效率较野生型均有所提升。将3个优势位点S9N、A11T、E518V进行组合叠加突变,突变体S9N/A11T/E518V发酵24 h获得了280.1 mg×L-1的对香豆酸产量,较野生型提高了65.9%,为本文获得的最高的对香豆酸产量。