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第一部分胡桃醌联合奥沙利铂对结直肠癌肿瘤细胞的作用及机制探讨目的:探讨胡桃醌（Juglone,Jug）联合奥沙利铂（Oxaliplatin,Oxa）对结直肠癌肿瘤细胞的作用及相关机制。方法:噻唑蓝（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT）法分别检测胡桃醌和奥沙利铂单药或联合用药对HT-29、HCT-116、LOVO和SW480细胞的生长抑制率。金正均法评价胡桃醌和奥沙利铂联合应用效应。蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）分别检测四株肠癌细胞的Pin1蛋白表达情况及单药或联合用药干预后对促凋亡相关蛋白Bax蛋白和抗凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白、周期相关蛋白CyclinD1蛋白和Pin1蛋白表达的影响。结果:1、胡桃醌和奥沙利铂对四株肠癌细胞均存在明显的抑制增殖作用,并呈剂量依赖性。胡桃醌作用于HT-29、HCT-116、LOVO和SW480细胞的IC50值分别为1.073±0.066ug/ml、1.076±0.099ug/ml、1.003±0.036ug/ml、1.006 ± 0.038ug/ml;奥沙利铂作用于HT-29、HCT-116、LOVO和SW480细胞的IC50值分别为21.833±0.952ug/ml、35.325±0.91 1ug/ml、20.362± 1.676ug/ml、22.174±2.111ug/ml。2、利用金正均法评价胡桃醌和奥沙利铂联合应用效应,结果显示:当胡桃醌和奥沙利铂联合应用作用于HCT-116、HT-29和SW480细胞时,无论两药给药比例大小,q值均大于1.15,联合应用效应为增强;作用于LOVO细胞时,仅最大比例联合用药时q值大于1.15,联合应用效应为增强,其他比例联合用药时为1＜q＜1.15,联合应用效应为单纯相加。3、Western blot检测结果显示:①HCT-116、HT-29、LOVO和SW480细胞的Pin1蛋白表达水平均高于HepG2肝癌细胞,其中HCT-116、HT-29和SW480细胞表达水平更高。②胡桃醌单独作用于HCT-116、HT-29和SW480细胞均能减少Pin1蛋白表达;作用于HCT-116和HT-29细胞,能增加Bax蛋白表达,减少Bcl-2蛋白表达,而CyclinD1蛋白表达则无明显变化;作用于SW480细胞,能减少CyclinD1蛋白表达,而Bax蛋白和Bcl-2蛋白表达无变化。③胡桃醌联合奥沙利铂作用于HCT-116、HT-29和SW480细胞均能增加Bax蛋白表达,减少了 Bcl-2蛋白、CyclinD1蛋白和Pin1蛋白表达。结论:1、胡桃醌对结直肠癌细胞具有较强的抗肿瘤作用,其机制与减少Pin1蛋白表达相关。2、胡桃醌联合奥沙利铂具有协同增效作用,其机制与增加促凋亡相关蛋白Bax蛋白表达,减少抗凋亡相关蛋白Bcl-2蛋白、周期相关蛋白CyclinD1蛋白和Pin1蛋白表达相关。第二部分 经iRGD修饰负载胡桃醌和奥沙利铂纳米红细胞膜靶向递药系统的构建及其对结直肠癌的作用评价目的:构建经iRGD修饰负载胡桃醌和奥沙利铂纳米红细胞膜靶向递药系统,并评价其对结直肠癌的作用。方法:利用低渗破膜法制备红细胞膜（red blood cell membrane,RBCm）。采用乳化挥发法制备RBCm-（Jug,Oxa）-NPs。采用聚乙二醇-磷脂衍生物将iRGD通过脂质嵌插的方式修饰在红细胞膜表面从而制备RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs,并对其包封率、载药率、粒径分布、电位、稳定性、体外释放及电镜下形态进行观察。MTT法比较Jug、Oxa、裸药联合（Jug,Oxa）、RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 和 RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs 对 HCT-116 和 HT-29 细胞的抑制增殖作用。流式细胞仪分别检测各组对细胞凋亡和细胞周期的影响。荧光显微镜观察RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs在体外细胞的摄取情况。活体成像试验观察RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs在荷瘤裸鼠体内实时分布情况。构建HCT-116荷瘤裸鼠模型,评价RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs的抑瘤作用。Ki-67免疫组化评价RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs在体内的细胞增殖作用。HE染色观察各组主要器官组织学形态变化,评价其生物安全性。结果:1、成功制备了经iRGD修饰的负载胡桃醌和奥沙利铂红细胞膜纳米粒子。1份制备条件为 Jug:Oxa=0.1mg:0.2mg,T=10min,功率=52W,乙腈=1ml,RBCm-NPs=1 份,DSPE-PEG-iRGD=15ug。2、制备的 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 粒径为 157.733±0.709nm,分散系数为0.103±0.003,Zeta 电位为-19.1±0.265;RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs 粒径为156.818±0.833nm,分散系数为 0.101±0.004,Zeta 电位为-19.5±0.238。3、RBCm-（Jug,Oxa）-NPs在5天内的粒径大小维持在160-180nm,第6天起粒径显著增大;RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs在7天内粒径大小均维持在160-180nm,前5天粒径大小维持在160-170nm,第6天起粒径略微增大。4、RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 在前 24h,Jug 释放为 38.787±0.401%,Oxa 释放为34.593±0.576%;RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs 在前 24h,Jug 释放为 38.93±0.369%,Oxa释放为35.093±0.494%。此后,在24h-168h内两纳米粒子均缓慢释放,168h后 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 的 Jug 累积释放为 66.383±0.462%,Oxa 累积释放为64.453±0.943%;RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs 的 Jug 累积释放为 66.81±0.539%,Oxa 累积释放为 65.317±0.655%。5、透射电镜（TEM）下 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 和 RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs均显示纳米粒子为类圆形,形态大小较均一。6、细胞增殖抑制试验结果显示:各组经药物干预24h后裸药联合（Jug,Oxa）组的细胞抑制率明显高于Jug组、Oxa组、RBCm-（Jug,Oxa）-NPs组和RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs 组（P≤0.000,n=3）,而在干预48h后,RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组细胞抑制率高于其他四组（与Jug组相比P≤0.000,与Oxa组相比P≤0.000,与裸药联合（Jug,Oxa）组相比 P=0.01＜0.05,与 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 组相比P=0.04＜0.05,n=3）。7、细胞凋亡试验结果显示:各组经药物干预48h后RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组细胞总凋亡率（早期凋亡率+晚期凋亡率）高于Control组、Jug组、Oxa组、裸药联合（Jug,Oxa）组和 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 组（P≤0.000,n=3）。8、细胞周期试验结果显示:各组经药物干预48h后裸药联合（Jug,Oxa）组、RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 组和 RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs 组分别与单药组（Jug 组、Oxa组）相比,G0/G1期比值显著升高,S期比值显著降低（P≤0.000,n=3）,而裸药联合（Jug,Oxa）组、RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 组和 RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组三组之间无显著差异（P＞0.05,n=3）。9、细胞摄取试验结果显示:RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组在HT-29和HCT-116细胞上均可见绿色荧光和红色荧光位于蓝色荧光周围,且在细胞质内相互重叠,并与RBCm-（Jug,Oxa）-NPs组相比荧光强度更高。10、活体成像试验结果显示:药物干预12h时,RBCm-（Jug,Oxa）-NPs组和RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组肿瘤组织区域可见微弱荧光信号。24h时间点及以后,两组荧光强度变化趋势相似,均在前48h呈上升趋势,后随着时间的推移呈下降趋势。但在同一观察时间点,RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs 比 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs表现出更强烈的荧光信号,且剥除的皮下瘤组织的荧光强度是最高的。11、抑瘤试验结果显示:给药组与对照组相比,皮下瘤体积生长均较对照组减慢,其中RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组最为明显,并且皮下瘤体积进行性缩小。在第15天剥离皮下瘤后进行测量体积和称重,RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组显著抑制了肿瘤体积（绝对体积）,与对照组相比P≤0.000,与裸药联合（Jug,Oxa）组相比 P=0.001＜0.05,与 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 组相比 P=0.048＜0.05（n=5）,减轻了肿瘤重量（绝对肿瘤）,与对照组相比P≤0.000,与裸药联合（Jug,Oxa）组相比 P=≤0.000,与 RBCm-（Jug,Oxa）-NPs 组相比 P=0.018＜0.05（n=5）,RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组无论是肿瘤体积还是重量的变化均有统计学差异。12、Ki-67免疫组化结果显示:RBCm-（Jug,Oxa）-iRGD-NPs组与对照组、裸药联合（Jug,Oxa）组和RBCm-（Jug,Oxa）-NPs组相比,具有高增殖能力的阳性肿瘤细胞数量最少,具有统计学意义（P值分别为P=≤0.000、P=≤0.000、P=0.02＜0.05,n=3）。13、HE染色切片显示各组均未见明显组织学形态变化。结论:1、胡桃醌联合奥沙利铂具有协同增效作用,其机制可能与促进肿瘤细胞凋亡,引起细胞周期G0/G1期阻滞相关。2、成功构建经iRGD修饰的负载胡桃醌和奥沙利铂纳米红细胞膜靶向递药系统,该递药系统稳定性良好,具有较好的肿瘤靶向性和抗结直肠癌作用,生物安全性可,具有临床应用前景。