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碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide，F2）是我课题组研究合成的一种新型钙拮抗剂，其对心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion,I/R）损伤以及心肌细胞的缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）损伤有良好的保护作用。前期研究表明，F2的保护机制还包括拮抗钙超载及抑制早期生长反应基因-1（early growth response gene-1，Egr-1） mRNA和蛋白的表达。进一步研究显示，F2一方面能够通过抑制H/R所致的经典钙依赖型 PKCα转位，进而抑制 Egr-1过表达，保护心肌细胞；另一方面能够激活非钙依赖型PKCε转位，保护心肌细胞H/R损伤；另外，在L-型钙通道缺如的心脏微血管内皮细胞上， F2对 H/R损伤依然有保护作用。这些研究结果提示，F2对心肌I/R损伤兼具有钙依赖和非依赖的双重保护机制。文献报道，作为丝裂原活化蛋白激酶家族（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）中一个重要的亚族，细胞外信号调节激酶（extracellular-signal regulated kinase,ERK1/2）对心肌I/R损伤具有重要的调节作用。因此，本研究以ERK1/2为切入点，首先观察了有钙及无钙条件下H/R心肌细胞中ERK1/2活性的变化；借助信号通路上特异性抑制剂或激动剂研究 ERK1/2相关信号通路在 H/R心肌细胞中的生物学功能；进一步探讨和明确F2保护心肌H/R损伤的钙依赖和非依赖的ERK1/2相关信号通路机制。 方法： 第一部分：钙依赖机制 1．将原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为11组：有钙对照（CaN）组、有钙缺氧/复氧（CaH/R）组、有钙H/R+F2（CaH/R+F2）组、有钙H/R+PKCα抑制剂G?6976（CaH/R+G?6976）组、有钙常氧+PKCα激动剂PMA（CaN+PMA）组、有钙H/R+F2+PMA（CaH/R+F2+PMA）组、有钙 H/R+维拉帕米（CaH/R+Ver）组、有钙 H/R+ERK1/2抑制剂U0126（CaH/R+U0126）组、有钙H/R+ERK1/2抑制剂PD98059（CaH/R+PD98059）组、有钙常氧+ERK1/2激动剂EGF（CaN+EGF）组和有钙H/R+F2+EGF（CaH/R+F2+EGF）组。CaH/R组细胞换用被高纯氮气饱和30 min的含钙缺氧液，置缺氧盒中37℃密闭培养2 h，然后换用正常培养基于常规条件下培养细胞1 h，建立H/R损伤模型；CaH/R+F2组、CaH/R+G?6976组和CaH/R+Ver组于缺氧前30 min、缺氧液及复氧培养基中分别给予F2（1×10-6 mol/L）、G?6976（1×10-6 mol/L）和Ver（2×10-6 mol/L）；CaH/R+U0126组和CaH/R+PD98059组于缺氧前30 min和缺氧液中分别给予U0126（2×10-5 mol/L）和PD98059（2×10-5 mol/L）；CaH/R+F2+PMA组于缺氧前先给予F230 min，接着给予PMA（1×10-7 mol/L）10 min，然后在缺氧液和复氧液中给予F2；CaH/R+F2+EGF组于缺氧前先给予F230 min，接着给予EGF（50 ng/ml）30 min，然后在缺氧液和复氧培养基中同时给予F2及EGF；CaN+PMA组于培养基中加入PMA常氧培养10 min，再换用新鲜培养基培养3 h；CaN+EGF组于新鲜培养基中加入EGF持续培养3.5 h；CaN组则于实验前换用新鲜培养基持续培养细胞3 h。 2．Western-blot方法检测心肌细胞磷酸化PKCα（p-PKCα）、PKCα、p-ERK1/2、ERK1/2、Egr-1蛋白表达的变化：分别借助 PKCα及 ERK1/2的激动剂和抑制剂，明确PKCα/ERK1/2/Egr-1信号通路是否参与心肌细胞H/R损伤及F2于其中的作用。 3．CCK-8（Cell Counting Kit-8）比色法检测心肌细胞存活率，Hoechst33342染色法检测心肌细胞早期凋亡情况，以反映心肌细胞的凋亡程度；双抗体夹心光化学测定法检测培养细胞上清液中肌钙蛋白（cardiac troponin I，cTnI）的漏出，以反映心肌细胞的损伤程度。 第二部分：非钙依赖机制 1．将原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为9组：无钙对照（0CaN）组、无钙缺氧/复氧（0CaH/R）组、无钙H/R+F2（0CaH/R+F2）组、无钙H/R+ERK1/2抑制剂U0126（0CaH/R+U0126）组、无钙H/R+ERK1/2抑制剂PD98059（0CaH/R+PD98059）组、无钙常氧+ERK1/2激动剂 EGF（0CaN+EGF）组、无钙 H/R+F2+EGF（0CaH/R+F2+EGF）组、无钙 H/R+PKA抑制剂 H89（0CaH/R+H89）组及无钙 H/R+PKA激动剂 Forskolin（0CaH/R+Forskolin）组。0CaH/R组细胞换用被高纯氮气饱和30 min的无钙缺氧液，置缺氧盒中37℃密闭培养2 h，然后换用无钙培养基于常规条件下培养细胞1 h，建立无钙液的H/R损伤模型；0CaH/R+F2、0CaH/R+H89和0CaH/R+Forskolin组于缺氧前30 min、无钙缺氧液及无钙培养基中分别给予F2（1×10-6 mol/L）、H89（1×10-5 mol/L）和Forskolin（1×10-5 mol/L）；0CaH/R+U0126组和0CaH/R+PD98059组于缺氧前30 min和无钙缺氧液中分别给予U0126（2×10-5 mol/L）和PD98059（2×10-5 mol/L）；0CaH/R+F2+EGF组于缺氧前先给予F230 min，接着给予EGF（50 ng/ml）30 min，然后在无钙缺氧液和无钙复氧培养基中同时给予F2及EGF；0CaN组则于实验前换用无钙培养基持续培养细胞3 h。 2． Western-blot法检测无钙液H/R心肌细胞ERK1/2活性的时效变化，检测PKA、磷酸化 ERK1/2（p-ERK1/2）、ERK1/2及 Egr-1蛋白表达的变化；酶联免疫吸附法（enzyme-linked sandwich immunoassay，ELISA）测定心肌细胞环磷酸腺苷（cyclic AMP， cAMP）的含量；借助PKA、ERK1/2激动剂及抑制剂，明确cAMP/PKA/ERK1/2/Egr-1信号通路是否参与心肌细胞无钙液H/R损伤及F2于其中的作用。 3．CCK-8（Cell Counting Kit-8）比色法检测心肌细胞存活率；Hoechst33342染色法检测心肌细胞早期凋亡情况，以反映心肌细胞的凋亡程度；普通光学及倒置相差显微镜下观察培养心肌细胞形态结构的变化，双抗体夹心光化学测定法检测培养细胞上清液中肌钙蛋白（cardiac troponin I，cTnI）的漏出，比色法测定培养细胞上清液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的漏出，以反映心肌细胞的损伤程度。 结果： 第一部分：钙依赖机制 1．有钙液H/R激活培养心肌细胞PKCα和ERK1/2，增加Egr-1蛋白表达，使细胞cTnI浓度升高，早期凋亡增加，存活率下降；F2及维拉帕米能够下调H/R所致p-PKCα、p-ERK1/2及Egr-1蛋白高表达，抑制细胞cTnI漏出，减少早期细胞凋亡，提高细胞存活率。 2．ERK1/2抑制剂U0126及PD98059可下调有钙液H/R所致p-ERK1/2及Egr-1蛋白高表达，抑制细胞 cTnI漏出，减少早期细胞凋亡，提高细胞存活率；ERK1/2激动剂EGF可拮抗F2对有钙液H/R心肌细胞p-ERK1/2及Egr-1蛋白高表达的抑制作用，拮抗F2的心肌保护作用，对常氧条件下Egr-1蛋白的表达无影响。 3．PKCα抑制剂G?6976可下调有钙液H/R所致的p-PKCα、p-ERK1/2及Egr-1蛋白高表达；PKCα激动剂PMA可拮抗F2对有钙液H/R心肌细胞p-ERK1/2及Egr-1蛋白高表达的抑制作用。 第二部分：非钙依赖机制 1．无钙液H/R可激活培养心肌细胞ERK1/2，在H2h/R1h时ERK1/2活性达到高峰。 2．无钙液H/R使心肌细胞皱缩、变圆，伪足及细胞间连接减少或消失，LDH、cTnI浓度升高，早期凋亡增加，存活率下降；F2能够下调无钙液H/R所致p-ERK1/2高表达，使细胞间连接明显增加，细胞LDH、cTnI漏出量降低，早期细胞凋亡减少，细胞存活率提高。 3. ERK1/2抑制剂U0126及PD98059可下调无钙液H/R所致p-ERK1/2蛋白高表达，抑制细胞 LDH、cTnI漏出，减少早期细胞凋亡，提高细胞存活率；ERK1/2激动剂 EGF可拮抗F2对无钙液H/R心肌细胞p-ERK1/2高表达的抑制作用，进而拮抗F2的心肌保护作用。 4．无钙液H/R对培养心肌细胞Egr-1蛋白表达无影响，F2、PD98059、U0126及EGF对无钙液H/R条件下Egr-1蛋白的表达亦无影响。 5．无钙液H/R使心肌细胞cAMP含量减少，对PKA蛋白表达无影响；F2对心肌细胞cAMP含量及PKA蛋白表达均无影响。 结论： 1．在培养心肌细胞中，有钙液及无钙液的H/R均可激活ERK1/2，导致细胞损伤。 2．F2可通过钙依赖的PKCα/ERK1/2/Egr-1信号通路抑制Egr-1过表达，这是其抗心肌细胞H/R损伤的一个重要机制。 3．F2可通过非钙依赖机制保护心肌细胞H/R损伤，这可能与其抑制H/R所致ERK1/2激活密切相关，但与cAMP/PKA信号通路及Egr-1蛋白表达无关。