乳腺癌已成为威胁女性生命健康的重要疾病之一，且患乳腺癌的女性数量逐年增高，其中20-30％是HER2过表达型患者。HER2作为一种临床验证的癌症靶标，治疗HER2过量表达肿瘤的药物是科学界研究的热点。目前治疗性单抗由于具有靶向性好、自身异源性低及毒副作用低等优点，在乳腺癌的临床治疗中应用广泛。但由于一部分HER2阳性的乳腺癌患者对单抗治疗不敏感，同时伴随着耐药性的产生，从而为其临床治疗提供了挑战。由此，治疗HER2过表达的抗体偶联药物（Antibody-drugs conjugates，ADCs）应运而生。ADCs是一类新型、高效的治疗肿瘤的药物，并以其优良的研究效果和低毒性成为乳腺癌治疗的新星。　　抗HER2的ADCs以抗体为载体，通过偶联剂与细胞毒性药物连接，利用抗体特异性识别靶细胞，细胞毒药物靶向作用从而发挥强抗肿瘤作用。ADC药物的作用机制是当抗体与肿瘤靶点结合后，ADCs进入肿瘤细胞，在细胞内裂解释放效应分子并引起细胞的凋亡。而ADCs高效杀伤肿瘤细胞的效应依赖于其是否能够特异、有效地进入肿瘤细胞，及细胞毒药物能否有效释放，因此研究其内吞，胞内转运，清除在药物评价中十分重要。但目前，对HER2介导的内吞和胞内转运的机制仍知甚少。　　本课题选用的治疗HER2过表达型乳腺癌ADCs作为研究对象，即T-DM1（Trastuzumab与DM1通过硫醚键连接）、P-DM1（Pertuzuma与DM1通过硫醚键连接）、P-MMAE(Pertuzumab通过二肽键偶联MMAE)、WBP265（曲妥珠单抗引入非天然氨基酸的265SD单抗与MMAF偶联）。其中T-DM1已于2013年上市，P-DM1、P-MMAE、WBP265均为正在研发的新药。通过监测单抗、细胞毒药物、偶联键等因素，对ADCS与受体相互作用以及它们在体外结合的影响，验证上述因素是否对它们的内吞速率和清除速率有影响，进一步阐述它们的作用机制。本文分为两部分，第一部分研究抗体偶联药物与HER2受体间的相互作用，第二部分研究抗体偶联药物在体外的内吞机制。　　第一部分研究不同ADCs与HER2受体间的相互作用。首先用SPR技术测定这些抗体与抗原相互作用。本文采用的是捕获法，具体实验方法：利用氨基氨基偶联试剂盒将抗人IgG(Fc)抗体偶联到CM5传感芯片葡聚糖基质表面，首先注射待测样品于检测通道，然后将HER2受体溶液（HBS-EP+缓冲液五个等梯度稀释液）注射于检测通道和参比通道，使得其与药物相结合；最后注射3M MgCl2进行芯片再生以备下一循环使用。用检测通道的响应值减去参比通道响应值，以扣除非特异性结合、补偿折射率所带来的误差。设置单循环动力学分析方法并运行。所得的曲线采用1:1 Lamgmuir模型描述拟合动力学模型，Biaevaluation分析软件进行数据处理，计算供试品的亲和动力学。KD值越小，抗原抗体的亲和力越大。　　用Biacore T200检测ADCs及阳性对照物（单抗：Trastuzumab、Pertuzumab、265SD）与受体HER2的KD值在10-10左右，故均具有很高的亲和力，活性高。根据Biacore判定标准一般认为KD值相差五倍以内，可以判定为亲和能力没有差别。T-DM1（KD值为133.9pM）与HER2的亲和力相当于Trastuzumab（KD值为94.2pM）；P-DM1、P-MMAE与HER2的亲和力（P-DM1 KD值为722.1pM，P-MMAE KD值为326.7pM）大于　　Pertuzumab与HER2的亲和力（KD值为1191pM），其中P-MMAE又强于P-DM1；同时单抗265SD与配体的亲和力与WBP265相当（265SD KD值为606.6pM，WBP265KD值为577.3pM）。与受体的亲和力，T-DM1和WBP265SD等于其对应的单抗，说明单抗连接小分子药物后对亲和力影响不大；但是连接效应分子后，对帕妥珠单抗影响较大，亲和力发生了较大影响。三种单抗与HER2的亲和力是Trastuzumab最强，265SD稍强，Pertuzumab最弱。同时T-DM1与HER2的亲和力大于P-DM1，因为T-DM1结合速率远大于P-DM1。　　接着，采用免疫荧光的方法分别测定ADCs、单抗与HER2的体外结合性质。流式细胞仪结果可见抗体与受体结合存在量效关系，在浓度0.3125-20μg/ml范围内，随着供试品浓度的增加，平均荧光强度（MFI）逐渐增强，浓度到达20μg/ml后，供试品浓度增加，荧光强度不变，符合受体的结合特征，即配体与受体结合具有饱和性。通过ADCs、单抗分别与HER2的结合曲线可知：T-DM1与HER2结合能力稍弱于Trastuzumab；P-DM1、P-MMAE弱于Pertuzumab，但P-MMAE稍强于P-DM1；WBP265弱于265SD。比较不同单抗其他结构相同的T-DM1、P-DM1的结合曲线可知，P-DM1稍大于T-DM1。比较三种单抗的结合能力，265SD最强，Pertuzumab其次，Trastuzumab最弱。　　第二部分研究不同ADCS在体外的内吞机制。研究发现，ADCS内吞进入胞内后，在溶酶体中降解。首先采用激光扫描共聚焦显微镜实时检测ADCs药物在SKBR3细胞中的转运和内吞速率，阳性细胞经T-DM1处理4小时后内吞进入到溶酶体，而单抗曲妥珠处理2小时到达溶酶体，说明T-DM1的内吞速率小于Tratuzumab；P-DM1与细胞共培养6小时后内吞进入溶酶体，P-MMAE处理8小时内吞到达溶酶体，而帕妥珠单抗4小时处理后，内吞到达溶酶体，说明P-DM1、P-MMAE的内吞速率小于Pertuzumab；而抗体偶联物WBP265和265SD单抗与细胞共培养8小时后均到达溶酶体，说明两者的内吞速率相同。在阴性细胞MCF7中，未观察到内吞现象。综合可知，抗HER2的抗体偶联药物的内吞速率小于其单抗的内吞速率。这一结果与体外结合性质研究的结果一致。　　接着应用免疫荧光的方法测定ADCs和单抗体外清除率。流式细胞仪结果显示，四种不同ADCs在乳腺癌SKBR3细胞内，平均荧光强度随着孵育时间延长而减弱，对比4℃处理条件下一直未变的平均荧光强度，表明ADCs内吞进入细胞后被降解。同时从体外消除曲线，可得出T-DM1的清除率小于曲妥珠单抗的清除率；P-DM1、P-MMAE的清除率小于帕妥珠单抗的清除率；WBP265的清除率小于265SD单抗的清除率。即抗体偶联药物的清除率普遍小于单抗的清除率。这一研究结果与体外结合性质、内吞速率实验一致。　　综上，本文应用SPR技术揭示ADCs及其相应地单抗与受体的相互作用的基本规律，观察其亲和动力学特征，进一步在体外应用免疫荧光的方法测定结合性质，为在分子、细胞水平上深刻理解乳腺癌导向治疗的机制、合理制定导向治疗方案及未来主攻方向等提供了重要理论依据。本研究中通过比较其清除率和内吞速率，为内化细胞生物学理论增添了新的内容，对药物机制研究、抗体偶联药物的最终优化和临床应用具有重要的指导意义。