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第一部分:原代培养的大鼠视网膜小胶质细胞中组织型纤溶酶原激活物的表达
应用原代培养分离的S-D大鼠视网膜小胶质细胞(MG),并通过不同浓度(0,3,10,30,100,300ng/ml)的脂多糖(LPS)刺激来建立小胶质细胞体外活化的模型,行细胞免疫荧光双标观察MG中0X42和t-PA的表达,同时应用Westernblot检测MG中t-PA的表达。
实验结果显示:分离的小胶质细胞贴壁24h后呈较小细胞体,大多数为圆形,少数呈短杆状。随着培养时间的延长,细胞逐渐伸出细长的分支,7d时易见多极或双极分枝状细胞。荧光显微镜下观察静息的小胶质细胞,细胞形态小,细胞突起少,0X42染色浅;而活化的小胶质细胞,细胞体增大,突起增多,0X42染色加深。未受刺激的小胶质细胞中可以观察到较微弱的t-PA的表达,呈淡红色弱荧光,经LPS作用后MG中的t-PA表达明显增强,并且随LPS的浓度增加而增强。Western blot的结果显示,各组MG中均有t-PA蛋白条带的表达,随着LPS激活的浓度的增加,条带的灰度逐渐增强。
本部分研究建立了视网膜小胶质细胞的体外培养和分离的成熟的方法,研究发现小胶质细胞可以被LPS作用后活化,活化的MG可以表达产生t-PA,并随着LPS刺激的浓度增大,表达增强。
第二部分:应用RNA干扰的方法敲减小胶质细胞中组织型纤溶酶原激活物的表达
我们根据文献报道和RNAi设计软件(oligoengine PdqAi)模拟验证,筛选高效的RNAi序列,将化学合成的siDNA片断与慢病毒载体进行定向连接和重组,其产物转化细菌感受态细胞,对长出的克隆先进行酶切鉴定,再对酶切鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对以确定载体的构建成功。将构建好的载体进行超纯去内毒素抽提,脂质体法共转染293T细胞,36-48h后通过荧光显微镜观察共表达的EGFP,测量获得的病毒载体的病毒滴度。然后将携带t-PA siRNA的慢病毒(PTM-sit-PA)或空白病毒转染小胶质细胞,流式细胞仪测量转染的效率,通过Real Time-PCR检测方法检测目的基因t-PA的表达抑制情况。
研究结果发现:酶切后的阳性克隆经过测序和分析比对发现与目的基因完全一致,说明载体构建成功。慢病毒质粒能够很好的转染293T细胞,转染阳性率85％,这样就确保了病毒包装的成功。最终获得慢病毒的滴度大约在5×108TU/ml。包装好的慢病毒(PTM-sit-PA)转染染小胶质细胞(MOI=10),两天后荧光显微镜下观察发现细胞高效表达EGFP,利用流式细胞仪检测感染小胶质细胞的荧光表达效率约88％。Real Time PCR检测发现PTM-sit-PA转染小胶质细胞的t-PA mRNA表达受到明显抑制,抑制效率约8096。
本部分实验成功的合成了大鼠t-PA基因的siRNA的慢病毒表达系统,研究结果提示该病毒能够高效率的转染小胶质细胞,高效率的下调t-PA的mRNA的表达水平。为进一步研究t-PA在小胶质细胞中活化中的作用奠定了基础。
第三部分:RNA干扰敲减小胶质细胞t-PA表达后对其活化反应的影响
应用携带t-PA siRNA的慢病毒(RNA干扰组)或空白对照病毒(对照组)分别转染小胶质细胞(MOI=10),转染2天后更换不含血清的含30ng/mlLPS的培养液活化MG,加入LPS后1,3,6,12,24小时各取培养液100μl,应用Elisa法检测培养液IL-1 β和TNF-α的浓度。24小时后取小胶质细胞行0X42和Iba-1免疫荧光。
实验结果发现0X42和Iba-1均可以在两组细胞表达,0X42的表达两组之间无明显差异,而Iba-1的表达RNA干扰组比对照组明显减弱。Elisa结果发现的IL-1β浓度除1小时两组之间无明显差别外,其余各时间点RNA干扰组均显著低于对照组,TNF-α浓度在各时间点RNA干扰组均低于对照组。
本部分研究表明在RNA干扰下调了小胶质细胞中t-PA的表达后,Iba-1的表达下调,小胶质细胞对IL-1β和TNF-α分泌减少。提示t-PA表达被敲减后,小胶质细胞的活化受到一定程度的抑制。