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围产期胎儿炎症反应综合征(Fetal Inflammatory Response Syndrome, FIRS)是造成早产和早产儿脑白质损伤的最常见原因,临床与流行病学资料证实早产儿脑白质损伤是儿童脑瘫的一个重要危险因素。由于早产儿脑白质损伤将影响神经系统发育,所以脑损伤后神经再生修复机制的研究将显得尤为重要。cAMP反应序列结合蛋白(CREB)是一种重要的核转录因子,调节启动子中具有环磷酸腺苷反应单元(CRE)的基因转录,在神经元再生、突触形成及学习记忆等方面具有重要的调节作用,是细胞内多种信号通路的一种关键成分。虽然国内外研究发现,缺氧缺血能诱导海马神经发生,但是对宫内炎症仔鼠脑白质损伤后海马神经发生的研究目前很少涉及,而且CREB信号通路是否参与脑白质损伤后海马神经发生和认知损害修复的分子机制尚不明确。本研究通过建立宫内炎症后仔鼠脑白质损伤模型,研究仔鼠生后不同时间点海马神经发生的规律；以及研究CREB信号通路是否参与脑白质损伤后海马神经发生；而且通过PI3K抑制剂LY294002和PDE4抑制剂Rolipram干预,探讨CREB信号通路在宫内炎症仔鼠脑白质损伤后海马神经发生中的作用和分子机制。从脑损伤自身修复角度进一步阐述CREB信号通路在神经发生及认知功能改善中的作用和分子机制,为防治早产儿脑白质损伤和儿童脑瘫的康复提供理论依据。目的：研究宫内炎症脑白质损伤后仔鼠生后不同时间点海马神经发生的规律,明确CREB信号通路是否参与调节脑白质损伤后海马神经发生,解释CREB信号通路在宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生中的作用和分子机制,阐明CREB信号通路在宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生及认知功能改善中的重要意义。方法：1.动物模型：实验动物分2组：①空白对照组：在各时间点和实验组等数量配对,②宫内炎症组：SD雌鼠孕15天于左右两侧宫颈内各注射大肠杆菌稀释液0.2mL,待其生产,制备宫内炎症后仔鼠脑白质损伤模型。各组仔鼠在不同时间点腹腔注射BrdU,24h后行主动脉灌注固定后制备3、7、14、28日龄脑组织石蜡标本,用免疫组织化学法检测BrdU阳性的增殖细胞数目变化；7日龄脑组织采用免疫荧光双标记(BrdU/Nestin)检测海马齿状回神经干细胞增殖情况；28日龄脑组织采用免疫荧光双标记(BrdU/NeuN、BrdU/GFAP)检测海马齿状回神经元与星形胶质细胞分化情况。2. Morris水迷宫法：水迷宫的水池直径为100cm,高60cm,水深51cm,水温(22±0.5)℃,站台高度为50cm,站台顶端平面10cm×10cm,平台没于水面下1cm,水池周围参照物保持不变。实验包括：①适应性训练：实验前1d让动物在无安全平台的水中适应性游泳2min；②定位航行试验：实验历时5d,每日分上下午系列,每个系列包括4次,操作者将大鼠面向池壁从不同象限入水,发现平台后,让其在平台上站立30s,将大鼠从平台上拿下来休息60s,再随机由下一象限入水进行试验,如果120s内找不到平台,则由操作者帮助其上平台,潜伏期记为最高分120s。记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)；③空间探索试验：第6天,撤去平台,取随机一点投大鼠入水池中,记录2min内大鼠穿过平台所在象限的时间。④探索实验结束后,休息三天,即水迷宫的第10天,再对全部大鼠进行一次水迷宫测试,方法同定位航行试验,测试其远期记忆的保持能力。3. CREB信号通路与神经发生：宫内炎症组和空白对照组动物在相应时间点(3、7、14、21、28日龄)断头取脑,应用RT-PCR及Western blot检测海马齿状回p-Akt、Survivin、p-CREB、BDNF、TrkB mRNA和蛋白质表达变化；应用免疫组化在28日龄对p-Akt、p-CREB、BDNF进行定位染色,进一步明确CREB信号通路的主要基因p-Akt、p-CREB和BDNF在海马齿状回神经细胞的表达情况。通过以上方法证明CREB信号通路参与宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生。4. CREB信号通路干预：宫内炎症组和空白对照组动物侧脑室微量注射PI3K阻滞剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路,同时应用磷酸二酯酶(PDE4)抑制剂Rolipram,增加脑内cAMP浓度从而激活CREB信号通路。两组动物分别在28日龄进行Morris水迷宫实验观测仔鼠学习记忆能力改变,并通过激光共聚焦显微镜研究相应年龄点仔鼠海马齿状回神经细胞增殖和分化的变化,以及通过Western blot检测CREB信号通路主要组分p-Akt、p-CREB及BDNF蛋白的表达变化,进一步阐述CREB信号通路参与脑白质损伤后海马神经发生的分子机制。结果：1.宫内炎症组子宫及胎盘内血管充血、水肿,并见大量中性粒细胞浸润；宫内炎症组仔鼠脑白质出现弥漫性病理改变,表现为结构稀疏、呈筛网状,少数出现严重的凝固性坏死和囊状病变。2.定位航行实验结果显示宫内炎症组仔鼠游泳轨迹杂乱无章,逃避潜伏期较空白对照组显著延长(P<0.05)；经过寻找隐藏平台训练,两组动物的逃避潜伏期均有所下降,第4天以后两组动物的逃避潜伏期无显著性差异(P>0.05)。空间探索实验结果显示宫内炎症组仔鼠的穿越平台次数较空白对照组显著减少(P<0.05),而且宫内炎症组仔鼠的远期记忆保持能力较空白对照组降低,逃避潜伏期较空白对照组显著延长(P<0.05)。3.宫内炎症组新生3,7,14日龄(P3,7,14)仔鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数较同日龄对照组显著增加(P<0.05),28日龄(P28)仔鼠海马齿状回BrdU阳性细胞数与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。宫内炎症组新生7日龄(P7)仔鼠海马齿状回BrdU+/Nestin+细胞数较对照组显著增加(P<0.01)。官内炎症组新生28日龄(P28)仔鼠海马齿状回BrdU+/NeuN+、BrdU+/GFAP+细胞数与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)4.宫内炎症组仔鼠海马p-Akt mRNA和蛋白质表达与对照组比较有显著性差异(P<0.05),于3,7,14日龄(P3,7,14)表达显著升高(P<0.05)。宫内炎症组仔鼠海马p-CREB mRNA和蛋白质表达与对照组比较有显著性差异(P<0.05),于14,28日龄(P14,28)表达显著升高(P<0.05)。宫内炎症组仔鼠海马BDNF mRNA和蛋白质表达与对照组比较有显著性差异(P<0.05),于3,7日龄(P3,7)表达显著升高(P<0.05)。免疫组化显示p-Akt、p-CREB、BDNF在海马齿状回有定位表达。5.予LY294002阻断PI3K/Akt信号通路发现LY294002组仔鼠逃避潜伏期较对照组显著延长(P<0.05),经过5天的寻找隐藏平台训练,LY294002组的逃避潜伏期未见显著下降,并在第10天表现了较差的记忆保持能力,两组比较有显著性差异(P<0.05)。LY294002组仔鼠海马齿状回BrdU+/Nestin+细胞数较对照组显著减少(P<0.05)。LY294002组仔鼠海马p-Akt、p-CREB和BDNF蛋白质表达较对照组显著降低(P<0.05)。应用磷酸二酯酶(PDE4)抑制剂Rolipram激活CREB信号通路,发现LY294002+Rolipram组仔鼠逃避潜伏期较LY294002+生理盐水组显著缩短(P<0.05),经过5天的寻找隐藏平台训练,LY294002+Rolipram组仔鼠的逃避潜伏期显著下降,并在第10天表现了良好的记忆保持能力,与LY294002+生理盐水组比较有显著性差异(P<0.05),而与空白对照+生理盐水组比较无显著性差异(P>0.05)。而且实验发现LY294002+Rolipram组仔鼠海马齿状回BrdU+/Nestin+细胞数较LY294002+生理盐水组显著增加(P<0.05)。LY294002+Rolipram组仔鼠海马p-Akt、p-CREB和BDNF蛋白质表达较LY294002+生理盐水组显著增加(P<0.05)。结论：1.宫内炎症脑白质损伤可以造成学习记忆和认知功能缺陷；宫内炎症组仔鼠海马齿状回BrdU+细胞数和BrdU+/Nestin+细胞数显著增加,表明脑白质损伤可以诱导海马神经发生；经过5天寻找隐藏平台训练,宫内炎症组仔鼠的逃避潜伏期显著下降,表明脑白质损伤后机体存在自身修复机制,可以改善学习记忆和认知功能缺陷。2.宫内炎症组仔鼠海马p-Akt、p-CREB与BDNF mRNA和蛋白质表达较对照组显著性升高,而且发现p-Akt、p-CREB、BDNF在海马齿状回有定位表达情况,说明CREB信号通路参与调节宫内炎症脑白质损伤后海马神经发生。3.LY294002能减少海马神经发生、加重学习记忆和认知功能缺陷并降低p-Akt、p-CREB和BDNF蛋白质表达；Rolipram能促进海马神经发生、改善学习记忆和认知功能缺陷并增加p-Akt、p-CREB和BDNF蛋白质表达；说明Akt/CREB/BDNF信号通路可能是调节海马神经发生,改善学习记忆和认知功能缺陷的重要分子机制。