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子宫内膜异位症(以下简称为内异症)是一种严重影响妇女身心健康的妇科常见疾病。虽然其发病率呈现增高趋势,但其病因及发病机制至今仍然不清。疼痛是该病的特征性症状,但内异症疼痛的临床治疗包括药物和手术治疗目前存在差,副作用大,费用高等严重问题。这严重降低患者的生活质量,影响其家庭生活,可导致相应的社会问题。就其根本原因是由于本症疼痛的发生机制至今仍然未明,因此,只有阐明内异症疼痛的发生机制,才能根本解决异位症的疼痛问题。近年研究发现,内异症病灶中出现与雌激素相关的神经纤维分布,这些病灶中的神经纤维主要为转导至脊髓背根节(DRG)神经元的C和Aδ初级感觉神经元,而其交感神经纤维却减少,导致病灶中神经纤维分布失行。研究还发现,雌激素能激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,内异症病灶中存在MAPK的高表达,给予鞘内注射MAPK抑制剂后可使内异症病灶缩小、神经纤维分布以及疼痛消失。由于内异症是一种雌激素依赖性疾病,内异症的疼痛也是一种内脏牵涉痛或病理性疼痛,MAPK信号通路参与病理性疼痛的发病机制已被公认,因此,我们认为雌激素也调控MAPK信号通路参与内异症疼痛的发病机制。最近研究发现,在神经病理性疼痛的发生机制中,雌激素主要是通过与神经细胞膜上的雌激素受体(ER)结合后,然后激活ER/代谢型谷氨酸受体(mGluR)连接信号转递信使信号入细胞内,导致细胞内信号传导通路级联反应,包括磷脂酶C(PLC)途径和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,促使环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)结合cAMP反应元件而激活转录,导致下游靶基因的转录增加或减少,从而调节神经纤维突触的可塑性变化以及神经递质的释放,最后参与神经病理性疼痛的发生机制。而CREB是一种依赖于MAPK信号通路的细胞内转录因子,CREB磷酸化可直接导致靶基因合成功能蛋白发挥生物学效应。显然,雌激素也调控MAPK/CREB信号通路参与内异症疼痛的发生机制。基于上述的设想我们设计了本研究,首先以不同雌激素水平建立不同内异症实验动物模型,比较不同雌激素模型的病灶大小和疼痛严重程度,以及同一模型不同雌激素水平之病灶大小和疼痛的差异,评价雌激素水平与内异症病灶及疼痛的关系；然后在不同模型中测定脊髓DRG中MAPK/CREB信号通路蛋白和基因表达水平,并在模型脊髓鞘内给予各种注射MAPK/CREB信号通路阻断剂干预,分析比较不同雌激素水平对MAPK/CREB信号通路蛋白和基因表达的影响,以及不同阻断剂干预对MAPK/CREB信号通路蛋白表达的影响,探讨雌激素调控MAPK/CREB信号通路的作用；最后在离体DRG细胞培养中以验证比较与在体的差异。以探索筛检内异症疼痛神经信号传导通路中的关键分子,为内异症疼痛提供更有效的治疗新靶。第一部分雌激素在内异症疼痛及病灶发生与发展中的作用目的：了解雌激素与内异症疼痛和病灶大小的关系方法：选择健康雌性未孕SD大鼠,按Berkley方法建立内异症SD大鼠实验模型。将模型按下列进行分组：1.不同模型四组：造模同时不切除双侧卵巢为卵巢未切除组(EEDO组),切除双侧卵巢为卵巢切除组(ENDO+OVX组),切除双侧卵巢后给予每天肌内注射苯甲酸雌二醇(0.1m1/kg)为雌激素应用组(ENDO+OVX+E2组),单纯进行手术而不做造模称为假手术组(Control组)。2.同一模型四组：雌激素应用组(模型组),1倍剂量组(1E组)、2倍剂量组(2E组)、4倍剂量组(4E组)4组。造模后6天开腹观察病灶大小并测量其体积[V=1/2axb2(a为最大横径,b为与之垂直的纵径)】,应用甩尾法测量热痛觉阈值,应用放免法测定血清雌激素水平结果：1.内异症SD大鼠模型均可见内异症病灶,其造模成功率达100%。2.模型病灶大小与血清雌激素水平显著正相关(P<0.05)。3.模型热痛觉阈值与血清雌激素水平显著正相关(P<0.05)。结论：1.本实验内异症造模成功率达100%。2.雌激素水平与内异症模型病灶大小及疼痛有关。第二部分MAPK/CREB信号通路介导雌激素致内异症疼痛的作用目的：分析比较不同雌激素和不同抑制剂干预后对MAPK/CREB信号通路蛋白及基因表达的影响,阐明雌激素调控MAPK/CREB信号通路的作用。方法：按第一部分的方法建立内异症SD大鼠模型,在造模后6天、12天及24天后取DRG组织,应用PCR方法检测DRG组织中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF基因的基因表达,应用Western Blot方法检测DRG组织中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF蛋白及蛋白磷酸化水平。在造模后24天在鞘内分别注射MEK.ERK、 mG1R5、mG1R1、ER. PKC、PLC抑制剂0.2ml (5μnol/ml)后两小时处死取DRG组织,按上述方法测定MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF蛋白及蛋白磷酸化水平结果：1.雌激素对DRG组织中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF的蛋白和基因表达水平的影响MAPK、CREB、SP及BDNF基因表达水平均随着雌激素浓度增加而增加,但随着时间延长,则出现下降趋势。低浓度雌激素促进MAPK、CREB、NGF及BDNF的蛋白表达以及MAPK蛋白磷酸化的表达水平,然而高剂量雌激素反而抑制MAPK、CREB、GF及BDNF的蛋白表达以及MAPK蛋白磷酸化的表达水平。2.各种抑制剂干预对MAPK、CREB、NGF及BDNF的蛋白表达水平的影响经各种抑制剂处理后发现,ERK通过mGluR1途径,CREB通过ERa/mGluR5/MEK1/2信号通路,NGF通过ERa/mGluR5/PKC/MEK1/2/CREB信号通路,而BDNF蛋白表达没有影响。结论：1.雌激素调节MAPK/CREB信号通路蛋白及基因表达水平。2. MAPK/CREB信号通路可能介导雌激素致内异症疼痛的分子机制。第三部分SD大鼠离体DRG细胞培养研究目的：通过比较分析离体与在体的差异,进一步明确雌激素调控MAPK/CREB信号通路的作用。方法：取16天孕鼠的DRG神经元细胞进行离体细胞培养。当DRG神经元细胞培养成单层贴壁细胞后进行分组干预实验,给予培养液中分别加入2uM MEK、50uM ERK、20uM mGlR5,13uM mG1R1,10uMER,10uM PKC、5uM PLC抑制剂后,给药后1h收集细胞,应用Western Blot方法检测DRG细胞中MAPK、CREB、SP、NGF及BDNF蛋白及蛋白磷酸化水平。同时给予1uM、10uM及100uM雌二醇不同浓度经15min、30min、60min及120min后,收集细胞,应用Western Blot方法检测DRG细胞中MAPK蛋白磷酸化水平。结果：1.各种抑制剂干预对MAPK、CREB、NGF及BDNF蛋白表达的影响经各种抑制剂处理后发现,ERK通过ERα/mGluR1/PLC/PKC途径,CREB通过ERa/mGluR1/PKC信号通路,BDNF通过ERa/mGluR5/PKC/MEK1/2/CREB信号通路,而NGF蛋白表达没有影响。2.雌激素干预对MAPK蛋白磷酸化水平的影响DRG细胞给予不同浓度雌激素处理后,ERK蛋白均迅速发生磷酸化,开始随着时间延长而其磷酸化水平增加,但随着时间再延长又开始逐渐下降,并在雌激素干预后30分钟达高峰。同时,ERK蛋白磷酸化水平也随着雌激素干预浓度增加而增加。结论：1.雌激素调节DRG细胞MAPK蛋白表达磷酸化水平。2. MAPK/CREB信号通路介导雌激素发挥生物学功能效应