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口腔扁平苔藓（oral lichen planus,OLP）是一种常见的慢性免疫炎性疾病,病情易反复,常迁延难愈。OLP的主要病理表现为口腔黏膜固有层内T细胞带状浸润和角质形成细胞凋亡。OLP的病因和发病机制尚未明确,大量研究表明T细胞介导的免疫应答和炎症反应在OLP中发挥了重要作用。细胞自噬是一种主要的细胞内溶酶体降解通路,在T细胞活化、增殖、凋亡及T细胞介导的免疫应答中发挥了重要的调节作用,参与多种免疫炎症性疾病的发生发展。然而,T细胞自噬是否在OLP发病中发挥免疫调节作用尚未可知。本课题拟从以下几个方面进行系统研究。第一部分口腔扁平苔藓T细胞自噬相关基因和自噬相关蛋白的差异表达及其临床意义目的:细胞自噬受自噬相关基因和自噬相关蛋白的严格调控,自噬相关基因或自噬相关蛋白的异常表达可能导致生物体内细胞自噬异常。本研究分析了OLP患者T细胞自噬相关基因和自噬相关蛋白的表达及其临床意义。方法:应用自噬基因微阵列检测OLP患者外周血T细胞中差异表达的自噬相关基因,并经实时定量RT-PCR验证分析其与OLP临床特点之间的关系。通过透射电镜观察外周血T细胞和黏膜组织中的自噬现象。采用免疫组化和免疫荧光双染法研究OLP病损组织及T细胞中自噬相关蛋白的表达及其临床意义。结果:胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1,IGF1）m RNA在OLP患者（尤其是中年、女性患者）外周血T细胞中的表达明显上调,自噬相关基因9B（autophagy-related 9 homolog B,ATG9B）m RNA在非糜烂型OLP患者外周血T细胞中的表达减少。在OLP外周血T细胞和病损组织中均明显观察到自噬体。自噬相关蛋白IGF1、ATG9B和LC3B在OLP病损组织和T细胞中的表达明显增多,而SQSTM1/p62仅在OLP病损T细胞中高表达。结论:OLP外周血和病损组织T细胞中均存在自噬异常。差异表达的T细胞自噬相关基因IGF1和ATG9B与OLP的临床特点具有显著相关性。细胞自噬在OLP病损组织中呈激活状态,而在病损T细胞中存在自噬降解异常,提示T细胞自噬异常可能参与了OLP的发病机制。第二部分IGF1调控PI3K/MTOR和MAPK/ERK通路介导的细胞自噬对T细胞生物学功能的影响目的:T细胞及其相关细胞因子网络调控在OLP的免疫发病机制中具有举足轻重的作用。作为重要的自噬调控信号,IGF1对细胞增殖、死亡和淋巴细胞免疫功能起到了关键的调节作用。本研究探索了IGF1介导的细胞自噬对T细胞增殖、凋亡、活化、炎性细胞因子分泌的作用及其调控机制。方法:分别正常培养和无糖无血清饥饿培养Jurkat T细胞。通过外源性IGF1以及相关信号通路特异性药理抑制剂（MTOR通路:雷帕霉素;PI3K通路:LY-294,002;自噬溶酶体降解通路:氯喹;细胞凋亡:Z-VAD-FMK）作用于T细胞,以确定这些通路在T细胞自噬调控和生物学功能中的作用。采用m RFP-GFP-LC3腺病毒标记自噬体,观察T细胞自噬状态及自噬流变化。利用CCK-8评估T细胞增殖活率。运用流式细胞术研究细胞凋亡和活化水平。采用ELISA分析T细胞分泌的炎性细胞因子水平。应用Western blot检测蛋白表达水平。结果:IGF1可诱导T细胞自噬。在无糖无血清营养应激条件下,IGF1促进T细胞增殖和活化,抑制T细胞凋亡及细胞因子IFN-γ的分泌。细胞凋亡抑制剂能够激活T细胞自噬和上调自噬流,并与IGF1协同促进自噬。IGF1还明显上调T细胞p-IGF1R、p-MTOR、PI3K-p85、总ERK1/2、p-ERK1/2、p38-MAPK的表达,拮抗LY-294,002和雷帕霉素对自噬的调控作用。此外,雷帕霉素和LY-294,002均可刺激T细胞内IGF1m RNA表达上调。结论:IGF1调控PI3K/MTOR和MAPK/ERK通路介导的细胞自噬,对维持T细胞内稳态和调控T细胞生物学功能具有重要作用。第三部分T细胞自噬在角质形成细胞-T细胞交互对话中的作用目的:OLP的免疫发病机制主要包括T细胞增殖、凋亡、炎性细胞因子分泌和角质形成细胞凋亡。角质形成细胞与T细胞之间的相互作用在OLP的发生发展中扮演着重要角色。细胞自噬是介导T细胞免疫应答的关键因素。本研究探讨了T细胞自噬异常对角质形成细胞-T细胞交互对话的影响。方法:通过慢病毒过表达或干扰T细胞ATG9B表达,观察T细胞自噬变化。使用CCK-8试剂盒检测T细胞和角质形成细胞增殖情况。通过Annexin V-APC/PI流式细胞术检测细胞凋亡。采用Western blot分析蛋白表达和ELISA检测炎性细胞因子分泌水平。结果:过表达或干扰ATG9B均可诱导T细胞自噬异常。ATG9Bhi OLP T细胞增殖受抑制,IGF1 m RNA和p-IGF1R的表达减少,而细胞凋亡增多。但ATG9B干扰的OLP T细胞增殖水平、IGF1 m RNA和p-IGF1R的表达量明显多于ATG9Bhi和对照组,而细胞凋亡减少。在共培养体系中,ATG9B干扰的OLP T细胞促进角质形成细胞增殖,ATG9Bhi T细胞抑制角质形成细胞增殖。与ATG9B干扰的OLP T细胞共培养组相比,ATG9Bhi OLP T细胞更显著抑制共培养体系中角质形成细胞的凋亡。外源性IGF1抑制了空白组、ATG9Bhi和ATG9B干扰的OLP T细胞的增殖,但促进健康人T细胞的增殖。IGF1还促进与ATG9B表达异常的外周血T细胞共培养的角质形成细胞增殖,上调与OLP T细胞和ATG9Bhi T细胞共培养的角质形成细胞凋亡。此外,ATG9B干扰的OLP T细胞可上调共培养体系中IFN-γ和TNF-α的分泌,ATG9Bhi OLP T细胞显著下调IFN-γ和TNF-α含量。但ATG9B异常表达的OLP T细胞可降低共培养体系IL-4的含量。结论:ATG9B依赖的OLP T细胞自噬异常,通过与IGF1联合作用,影响T细胞的生物学特性,调节共培养体系中的角质形成细胞生物学功能,提示T细胞自噬可能在OLP炎症微环境中发挥免疫调控作用。