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第一部分腹型肥胖和2型糖尿病患者血清游离脂肪酸谱的研究目的：建立一种可以精细测定多种血清游离脂肪酸(FFA)成分的高效液相色谱法(HPLC),探索2型糖尿病患者、腹型肥胖患者与健康人的血清FFA构成特点,以期为HPLC今后应用于FFA谱的临床检测和指导相关疾病患者的膳食结构调整准备条件。方法：建立测定血清棕榈油酸(POA)、花生四烯酸(AA)、亚油酸(LOA)、油酸(OA)、棕榈酸(PA)、硬脂酸(SA)等六种FFA成分的HPLC方法,测定对照组(Control)60例、腹型肥胖组(AOB)145例、腹型肥胖前期组(Pre-AOB)68例、超重/肥胖且腹围正常组(OW/OB-NWC)24例、肥胖的2型糖尿病组(OBDM)58例和不伴肥胖的2型糖尿病组(NOBDM)20例的血清FFAs谱,比较各组间FFAs和脂联素的差别,分析其与人体测量指标、生化指标、胰岛素敏感性、胰岛β细胞功能间的关系。结果：成功建立了可精细测定血清FFAs谱的柱前衍生反相HPLC方法,经方法学鉴定其精密度、稳定性、重复性均较好。各组间血清FFAs谱存在显著差异,与Control组相比,Pre-AOB、AOB组和2个糖尿病亚组饱和脂肪酸(SFA)浓度或构成比升高(SA和PA),单不饱和脂肪酸(MUFA)浓度或构成比降低(POA),多不饱和脂肪酸(PUFA)中AA升高。血清脂联素水平,Pre-AOB[1.53(1.34～1.88)μg/ml]、AOB组[1.50(1.22～2.15)μg/ml]和2个糖尿病亚组[1.41(1.24～1.60),1.52(1.28～2.11)μg/ml]均较Control组[1.76(1.46～2.06)μg/ml]显著降低,也与各组胰岛素敏感性状况符合。FFAs与人体测量指标、生化指标、胰岛素敏感性、胰岛β细胞功能指标间存在一定的相关性。小结：腹型肥胖、2型糖尿病患者存在着脂肪酸代谢的紊乱,并且腹型肥胖前期这种异常即己发生。SA等饱和脂肪酸对于胰岛素敏感性、β细胞功能、血糖、血脂谱甚至血压都是不利的,而POA等MUFA则具有一定的保护作用,PUFA中AA和LOA的作用不尽相同,AA具有较强的脂毒性,LOA则可能对血脂谱和尿酸、血糖等代谢方面有益。第二部分缺氧对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗、炎症和脂肪酸代谢的影响目的：从“脂肪组织缺氧(ATH)”这一全新视角切入,通过体外研究的方法,观察缺氧在胰岛素敏感性/抵抗、慢性炎症、脂代谢紊乱等方面对3T3-L1脂肪细胞的影响,并进一步通过分子生物学手段研究其可能的机制。方法：1%02处理分化成熟的鼠3T3-L1脂肪细胞24小时,蛋白质印迹法(Western Blot)和实时荧光定量逆转录PCR(Real-Time RT-PCR)检测缺氧反应性基因——缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运子1(GLUT-1)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白和mRNA水平以验证缺氧效果。采用Western Blot检测全细胞提取物IRS-1蛋白表达水平和蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平以观察低氧对胰岛素信号通路的影响；酶免法(ELISA)和Real-Time RT-PCR分别测定细胞培养基上清和脂肪细胞中炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1);脂肪细胞中脂肪因子(脂联素、瘦素)的水平也进行了检测。ELISA检测培养基中甘油和游离脂肪酸(FFA)以评估低氧对于脂肪细胞脂解的影响,Real-Time RT-PCR检测低氧对过氧化物酶体增殖物活化受体(PPAR-γ)、CCAAT盒增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸转运蛋白1(FATP1)、CD36、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)重要的脂代谢相关基因表达的影响。结果：低氧组3T3-L1脂肪细胞HIF-1α、GLUT-1蛋白水平分别升高7.63、8.34倍,mRNA水平HIF-1α、GLUT-1、VEGF分别升高32.1%、3.827和1.800倍。胰岛素信号传递方面,低氧组IRS-1蛋白水平较对照组显著降低,仅为对照的10.55%, Akt(Ser473)和Akt(Thr308)磷酸化也显著降低。低氧组脂肪细胞培养基上清中炎症因子水平显著升高,TNF-α、MCP-1分别升高35%、21%,脂肪细胞TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1等4种炎症因子mRNA水平分别升高29%、76%、81%和73%。低氧组脂肪细胞脂联素蛋白质和mRNA水平分别降低约75%和45%,瘦素mRNA水平则升高88%。低氧处理组培养基甘油(7.66+1.50VS.4.39±1.08μmol/L; t=-3.058,P<0.05)和FFA水平(7.15±0.10VS.2.78±0.07μmol/L; t=-61.958,P<0.001)均显著上升提示脂解增加。低氧处理组PPAR-γ、C/EBPα、FATP1、CD36、FABP4等脂代谢有关基因mRNA水平均显著降低,分别为对照组的42.57%、41.23%、52.67%、35.35%和50.23%(t值分别为9.948,4.69,5.364,6.126,12.785；P值分别为P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.001)。小结：缺氧对于脂肪细胞功能可产生广泛的影响和干扰。缺氧可通过影响IRS-1的表达和Akt的磷酸化阻碍胰岛素信号的传递而直接导致胰岛素抵抗。可促进脂肪细胞TNF-α等炎症因子的产生和分泌；可抑制脂联素并增加瘦素的表达。缺氧还可诱发脂解,并抑制脂肪细胞对于FFA的摄取。全文结论：腹型肥胖、2型糖尿病患者存在着脂肪酸代谢的紊乱,并且腹型肥胖前期这种异常即已发生。我们的研究结果与提出建议可通过调节饮食中这些不同脂肪酸的量和比例来改善胰岛素抵抗和脂代谢紊乱、预防代谢性疾病的发生的一些研究基本符合,但其机制和效果有待进一步研究。脂肪组织缺氧可能在肥胖状态下脂肪组织功能紊乱和胰岛素抵抗、慢性炎症等的发生、发展中发挥着重要的作用。