目的：现代多种研究结果发现，T细胞介导的免疫应答过程中．抗原特异性T细胞的激活需要两种信号，既需要T细胞上抗原受体(TCR)CD3复合体接受抗原提呈细胞提呈的抗原特异性信息（第一信号）外，还同时需要多种辅助因子提供的共刺激信号（costimulatory signal）（第二信号）的参与，否则可导致抗原特异性无应答状态即免疫耐受，T细胞处于克隆无能(anergy)状态，甚至出现T细胞的凋亡。CTLA-4是Cytotoxic T Lymphocytic Associated antigen-4的英文缩写，指的是细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4，又叫CD152，属于CD28家族成员，与CD28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达具有十分相近的关系，都是共刺激分子B7的受体，主要表达于被激活的CD4+和CD8+淋巴细胞。CTLA-4在活化T细胞膜上的表达量很少，仅为CD28的1/30～1/50，但其与B7的亲和力却是CD28与B7亲和力的20倍以上；作为淋巴细胞激活的共刺激信号，CTLA-4与CD28分子的功能是相反的。CTLA-4与B7结合后能抑制小鼠和人T细胞的激活，在T细胞活化中起负调节作用，是目前已知的最重要的抑制性粘附分子、免疫性受体之一[1]，是共刺激信号系统中重要的一个负调节因子。可溶性CTLA-4单克隆抗体(anti-CTLA-4mAb)可阻止CTLA-4与其天然配体结合，封闭CTLA-4对T细胞负性调节信号的传导，有效刺激T细胞增殖，诱导白介素-2的产生，增强T细胞对各种抗原的反应性，可激活机体免疫反应。可溶性CTLA-4单克隆抗体，已有研究显示其能有效的抑制移植物抗宿主反应，并已在支气管哮喘、自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、甲状腺疾病等自身免疫性疾病方面进行了较多研究探讨，针对于恶性淋巴瘤方面的研究较少。　　 恶性淋巴瘤(Malignant lymphoma，ML)是淋巴结和结外部位淋巴组织的免疫细胞肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变，包含不同临床表现和分子生物学特征的肿瘤。虽然在我国恶性淋巴瘤相对少见，但近年来新发病例逐年上升，每年至少超过25000例，死亡率为1.5/10万，占所有恶性肿瘤死亡位数的第11～13位，与白血病相仿。随着遗传学和分子生物学的发展，人们对ML有了更深刻的认识，认为其发病可能与病毒（EB病毒、逆转录病毒等）、细菌感染（如幽门螺杆菌等）、免疫缺损、某些自身免疫性疾病、电离辐射、遗传因素等有关，确切机制迄今尚未完全阐明。目前我们以手术治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗以及基因靶向治疗等治疗恶性淋巴瘤，但未能达到根治程度。进行恶性淋巴瘤靶向治疗的研究是必要的。　　 本研究通过观察CTLA-4单克隆抗体（anti-CTLA-4mAb）对荷瘤鼠T细胞淋巴瘤EL-4细胞裸鼠中的作用，研究在恶性淋巴瘤细胞增殖、凋亡中CTLA-4单克隆抗体的作用机制，希望能为恶性淋巴瘤的靶向治疗提供更多的科学依据。　　 方法：　　 1.培养鼠T细胞淋巴瘤EL-4细胞株，并将其传代用含有新生小牛血清的RPMI1640培养液(浓度为10％)培养鼠T细胞淋巴瘤EL-4细胞，将淋巴瘤EL-4细胞置于5％CO2饱和湿度、室温37℃的细胞培养箱中培养，于2～3天后进行EL-4细胞换液传代。　　 2.建立实验所需的荷鼠淋巴瘤EL-4细胞株裸鼠模型用4Gy剂量的钴60照射5周龄左右的Balb/c裸鼠，3天后于裸鼠右腋皮下接种EL-4细胞，剂量为0.2mL/只，相当于每1mL含3×107个EL-4细胞左右。待接种的瘤块增长至所需2～3cm后，处死荷瘤裸鼠。在无菌条件下将肿瘤瘤块分割成均匀的、小块，大小约2～3mm左右；随后分别注入10只Balb/c裸鼠（5周龄左右）头背部皮下。10天后，发现瘤块长势良好。随机分为2组，每组5只，分别为实验组、对照组，在肿瘤瘤块体积长至100mm3左右时开始给药anti-CTLA-4mAb。　　 3.荷鼠淋巴瘤EL-4细胞株裸鼠腹腔给药anti-CTLA-4mAb将anti-CTLA-4mAb稀释至浓度为10g/L，每只裸鼠腹腔内注射0.2ml（约2mg），共用anti-CTLA-4mAb治疗2天。　　 4.测量药物治疗后肿瘤细胞变化用anti-CTLA-4mAb治疗后，测量肿瘤体积变化，测量频率为每3～4天一次（2次/周），检测4周时间。　　 5.处死实验组、对照组裸鼠用anti-CTLA-4mAb治疗后4周，处死所有10只裸鼠，剖取肿瘤组织，将每只裸鼠的肿瘤组织分为5部分；并分别取血约1mL加入EDTA-K2抗凝。　　 6.观察用药前后肿瘤细胞病理形态学变化将裸鼠的肿瘤组织依次进行固定、脱水、透明、浸蜡、制蜡块、蜡块切片、HE染色、封片等步骤，随后于显微镜下观察对照组与实验组中各肿瘤组织形态的变化。　　 7.检测用药后肿瘤组织中CD4+、CD8+T细胞浸润情况将裸鼠的肿瘤组织依次行固定、石蜡包埋、切片、SP法染色等。以PBS缓冲液视为阴性对照，若细胞内出现棕黄色则判定为阳性细胞（参照试剂说明进行阳性结果判定）。高倍镜(×200)下随机观察每张组织切片中的5个高倍视野，计数200个细胞/每高倍视野，计数阳性细胞百分比，将其作为结果。　　 8.应用流式细胞术检测裸鼠外周血中用药前后的CD4+CD25+Tr细胞变化情况分别取用0.1mlEDTA-K2抗凝血，分别加入20μL的CD4、CD25抗体，于正常室温情况下孵育30分钟后加入红细胞裂解液使红细胞裂解，并用破膜剂、固定剂处理红细胞，其后应用Expo32 ADC上机进行免疫荧光数据分析，用Muticycle AV分析对DNA细胞周期进行分析。　　 9.应用RT-PCR检测EL-4细胞c-myc、β-catenin、survivin和cyclinD1mRNA四种基因的表达提取10只裸鼠中每只肿瘤细胞RNA总数量，并行RNA纯度鉴定以及RNA完整性检测，行引物（所有RT-PCR引物均由上海生物工程公司合成）设计，将细胞总RNA预温，后加入逆转录-聚合酶链反应体系进行反转录，得到cDNA;再将PCR扩增后取其扩增后产物，在琼脂糖凝胶加样孔中加样打孔，进行电泳30min，其后再用凝胶成像系统分析并结果，并拍摄图象记录。以Gel-Pro Analyzer3.1分析软件进行分析条带光亮度，进行半定量分析实验，并计算相对系数。　　 10.检测肿瘤细胞周期的变化及凋亡情况将裸鼠肿瘤组织制备为单细胞悬液，上流式细胞仪应用FCM检测肿瘤细胞周期的变化及凋亡。　　 结果:　　 1.实验组显示CTLA-4单克隆抗体可以抑制鼠淋巴瘤EL-4细胞在裸鼠体内的增殖变化，并与时间相关。药物作用时间越长，实验组中肿瘤细胞体积较对照组中的肿瘤细胞体积增长就越缓慢。　　 2.高倍镜下可见实验组中的肿瘤细胞较对照组浸润程度较低，肿瘤细胞大小中等，核多为圆形，核膜清楚，核分裂相少见；对照组中裸鼠在荷淋巴瘤EL-4细胞后的肿瘤细胞呈弥漫浸润，其大小中等，细胞核呈圆形或不规则圆形，细胞核核膜边界清楚，胞核分裂象易见。　　 3.实验组中裸鼠肿瘤组织中CD4+及CD8+T细胞的比例降低；免疫组化分析结果显示实验组CD4+T细胞比例为（20.1±0.9）％，对照组CD4+T细胞浸润比例为（53.9±1.1）％，P=0.003;实验组CD8+T细胞比例为（14.2±0.8）％，对照组CD8+T细胞浸润比例为（26.6±1.0）％，P=0.017；两组有显著差异(P＜0.05)。　　 4.实验组中裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr细胞的比例降低。实验组CD4+CD25+Tr细胞的比例为（1.81±0.89）％，对照组CD4+CD25+Tr细胞的比例为（5.81±3.61）％，P=0.006;对照组与实验组有显著差异(P＜0.01)。　　 5.RT-PCR检测中检测出鼠淋巴瘤EL-4细胞扩增出与拟扩增分子片段大小相符的特异性条带。实验组鼠淋巴瘤EL-4细胞-catenin mRNA表达水平没有明显变化，与对照组相比没有统计学意义(P＞0.05)。而实验组鼠淋巴瘤EL-4细胞β-catenin/TCF下游靶基因c-myc、Cyclin D1和survivin mRNA表达水平却降低了，与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。　　 6.FCM检测结果显示，实验组中EL-4细胞出现亚二倍体凋亡峰，且EL-4细胞的凋亡率大大增加，实验组的细胞凋亡率(15.31％)明显高于对照组细胞的凋亡率(3.29％)，P＜0.01；实验组显示经CTLA-4单克隆抗体作用后肿瘤细胞中处于G0/G1期细胞(27.69％)较空白组(17.03％)明显增加，P=0.011;S期细胞明显减少，P=0.004;两组间差异有显著性（P＜0.05），CTLA-4单克隆抗体能使细胞停滞在G0/G1期。　　 结论:　　 1.在应用CTLA-4单克隆抗体治疗后，CTLA-4单克隆抗体可减慢鼠淋巴瘤EL-4细胞在裸鼠体内的增殖，与时间呈正性相关。　　 2.经CTLA-4单克隆抗体治疗后的裸鼠体内肿瘤细胞，其浸润程度降低.　　 3.裸鼠肿瘤组织于CTLA-4单克隆抗体治疗4周后，肿瘤组织CD4+T细胞及CD8+T细胞浸润比例降低。　　 4.经CTLA-4单克隆抗体治疗后，裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr细胞的比例降低。　　 5.裸鼠肿瘤组织于CTLA-4单克隆抗体治疗4周后，其c-myc、survivinmRNA和CyclinD1表达水平均降低。　　 6.经CTLA-4单克隆抗体治疗后的肿瘤细胞停滞在G0/G1期，CTLA-4可以增加瘤细胞凋亡率。