【摘 要】
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循环肿瘤细胞（CTC）的检测对于癌症的早期诊断、治疗及转移研究至关重要。然而,由于癌症早期患者血液中CTC的含量极低,这就对其分离和富集提出了挑战。本文通过在玻璃及聚苯乙烯等基材上构建仿红细胞外层膜的表面（CMMS）以排斥血细胞的粘附,然后将肿瘤细胞靶向配体叶酸（FA）和多肽（RGD）锚定在CMMS上以增强表面对肿瘤细胞的捕获。这种既能够捕获肿瘤细胞又能抵抗血细胞粘附的表面,因其制备方法简便、普适
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循环肿瘤细胞（CTC）的检测对于癌症的早期诊断、治疗及转移研究至关重要。然而,由于癌症早期患者血液中CTC的含量极低,这就对其分离和富集提出了挑战。本文通过在玻璃及聚苯乙烯等基材上构建仿红细胞外层膜的表面（CMMS）以排斥血细胞的粘附,然后将肿瘤细胞靶向配体叶酸（FA）和多肽（RGD）锚定在CMMS上以增强表面对肿瘤细胞的捕获。这种既能够捕获肿瘤细胞又能抵抗血细胞粘附的表面,因其制备方法简便、普适性强、成本低廉,选择性捕获癌细胞的性能优异、检测过程简单易行,可能会在癌症诊断、靶向治疗等生物医药方面发挥重大作用。本论文的主要研究工作及结果分为以下三部分:（1）叶酸（FA）靶向配体涂层的构建及性能优化研究。建立了以仿贻贝万能粘附的聚多巴胺层为介导层,在玻璃及聚苯乙烯等基材表面酰胺化偶联构建由PMEN91（含有活性酯基团和磷酰胆碱两性离子随机共聚物）和羧基化聚乙二醇（PEG,5k Da）组成的抗粘附性仿细胞膜结构涂层（CMMS）,再将配体FA与PEG链末端羧基进行偶联,建立了一种能与肿瘤细胞特异性结合的组合涂层（CMMS/FA）的共性方法。通过表面等离子体共振（SPR）仪在线构建各涂层并定量分析,静态水接触角（WCA）、原子力显微镜（AFM）对涂层进行表征,所有结果均显示各涂层构建是成功的。混合细胞粘附实验结果证实,优化后的CMMS/FA涂层表面在混合细胞（L929:He La=100:1）中对He La细胞的捕获率为23.5%,纯度高达94.4%。（2）多肽（RGD）配体涂层的构建及性能优化研究。将叶酸配体替换为多肽偶联在CMMS涂层表面上,构建得到RGD配体涂层（CMMS/RGD）。通过探索浓度、温度、溶剂、反应时间对多肽涂层构建的影响,获得了调控涂层制备参数优化性能指标技术方法。通过WCA、AFM、XPS对各条件下构建的涂层进行表征,所有结果都说明多肽涂层的构建是成功的。细胞粘附的定量分析结果显示,CMMS/RGD涂层不仅能够抵抗能正常细胞（L929）的粘附,从混合细胞（L929:He La=100:1）中捕获He La细胞的捕获率提高到60.1%,且捕获纯度高达93.8%。（3）双靶向配体涂层的构建及在肿瘤细胞捕获中的应用研究。在探索的最佳反应条件下将FA和RGD依次锚定在CMMS表面向外伸展的PEG羧基上,建立了一种构建双靶向配体含量可控涂层（CMMS/FA-RGD）的制备方法。通过调控两种配体的表面密度,实现对癌细胞结合作用的筛选优化。对CMMS/FA-RGD涂层进行系统的表征发现,双靶向配体涂层比任意单靶向涂层的的静态接触角升高8-12°,表面形貌的粗糙度增大3.2nm左右,而且表面元素分析的结果显示双靶向配体涂层中各元素的含量与单靶向配体涂层的结果类似。表面等离子体共振（SPR）仪在线可控构建CMMS/FA-RGD涂层结果发现,优化得到的表面FA和RGD配体密度分别为22 ng/cm~2、9 ng/cm~2。CMMS/FA-RGD涂层在混合细胞（L929:He La=100:1）中对He La细胞的捕获率为91.4%,在标记癌细胞的全血（WBC:He La=2120:1）中对He La的捕获率为90.6%,捕获纯度均高于80%。与正常培养的He La和MCF-7细胞相比,捕获富集细胞的存活率为97%,为进一步开展癌细胞检测提供了条件。
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