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目的牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）成骨速率达婴幼儿生长发育速度的4至6倍,远超骨折愈合,其成骨机制复杂,目前尚无定论,成为当今国内外研究聚焦的热点之一。骨是高度血管化的组织,血管形成是新骨形成的先决条件。本课题组在前期DO成骨机制的序列研究中,发现DO组织内的血管快速形成,而缺氧微环境、内皮祖细胞（Endothelial progenitor cells,EPCs）和非编码RNA在其中起到举足轻重的作用。因此,本课题旨在探讨HIF-1α诱导下lncRNA（TCONS＿00072170）-miRNA143-KRAS调控EPCs参与牵张成骨血管形成的机制,为进一步阐明DO快速成骨的生物学机制提供新的思路。方法1、HIF-1α参与牵张成骨血管形成机制的初步探索:取健康犬6只,随机分为2组。构建犬下颌骨DO和骨折（bone fracture,BF）动物模型,于术后第14天处死动物并取材。通过HE染色观察牵张区新生血管的结构;通过免疫荧光染色检测组织中CD133、CD34、HIF-1α、ZEB1、β-catenin、beclin1蛋白水平;通过RT-PCR检测组织中HIF-1α、VEGF、b FGF、E-cadherin、ZEB1、β-catenin、beclin1的mRNA表达水平。2、HIF-1α对骨髓EPCs血管形成的作用及机制:分离培养原代犬骨髓EPCs,使用Co Cl2来构建体外细胞缺氧模型。通过CCK-8、细胞迁移实验检测缺氧对EPCs增殖、迁移的影响;通过RT-PCR与WB检测细胞内HIF-1α、VEGF、b FGF、E-cadherin、ZEB1、β-catenin、beclin1的mRNA及蛋白表达水平;通过免疫荧光染色检测细胞内ZEB1、β-catenin、beclin1蛋白水平。3、lncRNA（TCONS＿00072170）筛选、验证及靶基因分析:通过RT-PCR对课题组前期高通量测序获得的10条转录本novel＿lncRNA进行验证并筛选出与HIF-1α相关的novel＿lncRNA;通过生物信息学的方法对筛选出来的novel＿lncRNA进行靶miRNA预测,以及靶miRNA的靶基因预测;通过荧光素酶结合实验对预测结果进行验证。4、lncRNA（TCONS＿00072170）-miRNA143-KRAS调控EPCs血管形成体外实验研究:构建慢病毒质粒对EPCs中的lncRNA（TCONS＿00072170）与miRNA143分别进行过表达和沉默。通过CCK-8、细胞迁移实验、细胞成管实验、检测lncRNA（TCONS＿00072170）与miRNA143对EPCs增殖、迁移、体外成管的影响;通过RT-PCR检测细胞内HIF-1α、VEGF、b FGF、lncRNA（TCONS＿00072170）、miRNA143、KRAS、PI3K、AKT的mRNA表达水平;通过WB检测细胞内HIF-1α、VEGF、b FGF、KRAS、PI3K、AKT的蛋白表达水平。5、lncRNA（TCONS＿00072170）调控牵张成骨血管形成动物实验研究:取健康犬24只,随机分为4组,分别是对照组（Con）、EPC组（EPC）、病毒对照组（NC）、lncRNA（TCONS＿00072170）过表达组（TCONS＿00072170）。构建犬下颌骨牵张成骨动物模型,取材时间点为牵张成骨术后第14天（即牵张结束即刻）和第28天（牵张结束固定14天）。通过大体观察、CBCT、micro CT观察牵张区新骨形成和改建情况;通过HE染色观察牵张区新生血管及骨小梁的结构;通过CD31免疫组织化学染色和新生血管计数评价牵张区血管形成情况;通过碱性磷酸酶检测评估牵张区碱性磷酸酶表达情况。结果1、HE染色结果表明DO与BF组牵张及骨折间隙内均可见大量新生组织。DO组的牵张间隙可见细胞丰富的纤维结缔组织,纤维沿着牵张力的方向排列,纤维间可见大量的扁平细长的成纤维细胞,纤维间隙内可见丰富的红细胞,炎性细胞少见;BF组的骨折间隙可见较DO组稀疏的纤维结缔组织,大量炎症细胞浸润,纤维排列无序,纤维间隙内红细胞较DO组少。组织免疫荧光染色结果表明,CD34、CD133、HIF-1α、beclin1及β-catenin在DO组牵张区新生组织中的表达高于BF组骨折区;而ZEB1的表达则是DO组低于BF组。RT-PCR结果表明,VEGF、b FGF、HIF-1α、beclin1、β-catenin及E-cadherin在DO组牵张区新生组织中的表达高于BF组骨折区;而ZEB1的表达则是DO组低于BF组。2、在培养24 h和48 h后,与对照组相比,0.1 mmol/L与0.2 mmol/L Co Cl2可以促进EPCs的增殖与迁移;而0.5 mmol/L Co Cl2则抑制EPCs的增殖与迁移。RT-PCR与WB结果表明,与对照组相比,0.1 mmol/L Co Cl2可以促进EPCs中VEGF、b FGF、HIF-1α、β-catenin、beclin1、E-cadherin的表达,抑制ZEB1的表达。免疫荧光化学染色结果表明,与对照组相比,0.1 mmol/L Co Cl2可以促进EPCs中β-catenin、beclin1的表达,抑制ZEB1的表达。3、RT-PCR结果表明lncRNA（TCONS＿00072170）与HIF-1α相关。miRDB网站预测lncRNA（TCONS＿00072170）可能与miRNA143结合、miRNA143的靶基因为KRAS。荧光素酶结合实验验证了lncRNA（TCONS＿00072170）与miRNA143、miRNA143与KRAS的靶向关系4、转染沉默lncRNA（TCONS＿00072170）慢病毒后,EPCs的增殖、迁移、成管能力较对照组下降,HIF-1α、VEGF、b FGF、KRAS/PI3K/AKT表达下降;转染过表达lncRNA（TCONS＿00072170）慢病毒后,EPCs的增殖、迁移、成管能力较对照组上升,HIF-1α、VEGF、b FGF、KRAS/PI3K/AKT表达升高。转染沉默miRNA143慢病毒后,EPCs的增殖、迁移、成管能力较对照组上升,HIF-1α、VEGF、b FGF、KRAS/PI3K/AKT表达升高;转染过表达miRNA143慢病毒后,EPCs的增殖、迁移、成管能力较对照组下降,HIF-1α、VEGF、b FGF、KRAS/PI3K/AKT表达下降。5、通过CBCT和micro CT检查发现,牵张成骨术后第28天各实验组牵张间隙骨密度较术后第14天升高,对照组牵张间隙骨密度最低、lncRNA（TCONS＿00072170）过表达组骨密度最高、EPC组和病毒对照组骨密度无明显区别。牵张成骨术后第14天各实验组HE染色、CD31免疫组化染色及新生血管计数结果表明,对照组牵张间隙血管成熟度较低、血管计数少,lncRNA（TCONS＿00072170）过表达组血管成熟度高、血管计数多,而EPC组和病毒对照组无明显区别。牵张成骨术后第28天各实验组HE染色结果显示,对照组牵张间隙新生骨小梁较细长,lncRNA（TCONS＿00072170）过表达组牵张间隙新生骨小梁更粗大。牵张成骨术后第28天各实验组碱性磷酸酶检测结果表明,lncRNA（TCONS＿00072170）过表达组牵张间隙碱性磷酸酶活性最高。结论1、HIF-1α可能参与诱导了体内DO牵张间隙与体外EPCs的血管生成,MET、Wnt/β-catenin信号通路及自噬可能参与了其中的作用机制。2、lncRNA（TCONS＿00072170）促进EPCs的成血管向分化,而miRNA143则起到抑制的作用。lncRNA（TCONS＿00072170）-miRNA143-KRAS信号轴参与调控EPCs内的血管生成。3、lncRNA（TCONS＿00072170）基因修饰的EPCs能够促进DO牵张间隙血管形成与新骨形成。