肺癌是全世界范围内发病率最高,死亡率最多的恶性肿瘤,放疗是主要治疗方法之一,众所周知血管生成是肿瘤生长和代谢过程中不可缺少的环节,正常情况下肿瘤邻近血管内皮细胞出芽形成新的血管,放射治疗在杀伤癌细胞的同时也破坏邻近现有血管机构,最新研究表明放射治疗情况下癌细胞处于乏氧微环境下会释放因子重构血管结构使其复生,研究表明,通过药物干扰肿瘤血管相关的生物学能力,可对肿瘤的生长、代谢和恶性侵袭产生相应的调节和抑制作用。β-榄香烯(β-elemene)是从中草药温郁金中,运用现在医药科学技术提取出的有效天然化合物,对放射治疗具有一定的增加相关敏感性的作用。基于对药物的前期作用的相关性研究发现,β-榄香烯可以增加放射治疗肺癌时的放疗敏感度,对肺癌细胞凋亡、周期、DNA损伤修复等方面有一定干预作用。本实验使用的是提纯注射剂,前期研究发现β-榄香烯可以通过抑制肺癌组织血管生成及VEGF表达发挥放疗增敏作用,说明该药的放疗增敏机制与肿瘤血管有关,但其对HUVEC细胞相关作用,及其在正常和放疗情况下是否作于肿瘤细胞影响其分泌相关蛋白或因子影响血管内皮细胞未见报道。研究目的:本研究旨在探讨β-榄香烯对HUVEC细胞相关作用,及通过体外建立的A549放疗模型模拟体内肺癌放疗环境,直观观察放疗条件下药物作用于A549细胞对于HUVEC细胞的相关作用。方法:第一部分:β-榄香烯对HUVEC细胞的抑制作用研究1.使用MTT方法检测不同浓度β-榄香烯对HUVEC细胞的抑制能力及最佳实验浓度(IC50)。2.使用划痕、transwell、检测β-榄香烯对HUVEC迁徙能力的影响。3.采用tube formation实验检测β-榄香烯对HUVEC细胞管腔结构形成能力的影响。4.采用Western blot的实验方法检测相关蛋白表达。第二部分:β-榄香烯结合放疗对肺癌细胞诱导HUVEC细胞的影响1.采用MTT方法检测不同浓度β-榄香烯对肺癌细胞系A549细胞的抑制能力及最佳实验浓度(IC50)。2.将A549细胞分为:对照组:正常培养基培养;放射组:DOSE RATE 600 6MV下4Gy照射;药物组:β-榄香烯+培养基培养24h;药物联合放射组:β-榄香烯+培养基培养24h后予DOSE RATE 600 6MV下4Gy照射。收集四组上清液,即为实验所用条件培养基(conditionedmedium,CM),四组条件培养基分别培养HUVEC细胞24h,采用Transwell实验检测四组条件培养基培养的HUVEC细胞的迁徙能力。3.采用Hoechst荧光染色实验检测各条件培养基中HUVEC细胞凋亡情况。4.使用Western Blot的实验方法检测条件培养基诱导的HUVEC细胞中相关蛋白表达。结果第一部分1.β-榄香烯作用HUVEC细胞24h的IC50为84.26μg/ml。2.随着药物浓度的增加,β-榄香烯对HUVEC细胞的迁移能力的抑制力逐渐增强。3.β-榄香烯对HUVEC细胞管腔形成能力具有抑制作用,伴随着药物浓度增加抑制作用明显增强。4.与对照组相比β-榄香烯对HUVEC细胞增殖相关蛋白PI3K、Akt及erk的表达无明显变化,但p-erk和p-akt均有降低表达的效果,对迁移蛋白MMP-9和MMP-2的表达呈现出浓度依赖性降低。第二部分1.β-榄香烯对A549细胞增殖具有抑制作用,IC50值为172.89μg/ml。2.与对照组相比,药物组诱导的HUVEC细胞的迁移能力有一定抑制,药物联合放射组诱导的HUVEC细胞迁徙能力抑制效果更加明显。3.与对照组相比,药物组对HUVEC细胞凋亡效果不明显,药物联合放射组的HUVEC细胞凋亡效果明显。4.与对照组相比,药物联合放射组明显抑制HIF-1α和VEGF蛋白表达,凋亡相关蛋白 AKT、P-AKT、Caspase-3 及 Bcl-2 中 p-akt、Caspase-3 和 Bcl-2 的表达量降低。结论1.β-榄香烯可以抑制HUVEC细胞增殖能力,对细胞的迁移能力及管腔形成能力的抑制效果呈浓度依赖性,并明显降低相关蛋白表达水平。2.β-榄香烯可以抑制A549增殖,β-榄香烯联合放疗可以作用于A549细胞,改变肿瘤微环境,抑制肿瘤微环境中的HUVEC细胞迁移,促进HUEVC细胞凋亡,并抑制相关蛋白表达。