炭疽是由炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）引起的急性、热性、败血性人畜共患传染病。由于炭疽杆菌危害性大、容易获得、培养简单、便于大量生产与长期保存,也容易施放。人畜一旦吸入空气中漂浮的炭疽杆菌粉末就会被感染,再加上肺型炭疽的高致命性,使炭疽杆菌成为最早被使用的生化武器之一。2001年美国9.11事件之后的炭疽邮件事件给全世界带来了炭疽恐慌,让炭疽这种古老的疾病再次引起世人的关注。炭疽芽孢在机体体内萌发形成繁殖体,繁殖体一旦进入血液便大量的增殖并分泌出高致病性的炭疽致死毒素和炭疽水肿毒素。这时使用任何抗生素治疗也无效果,此时需要对机体使用抗炭疽毒素药物来阻止炭疽毒素对机体的损伤甚至致死。炭疽致死毒素是炭疽芽孢杆菌高度致病性的主要因素,它包括保护性抗原PA（protective antigen）和致死因子LF（lethal factor）两种成分,研究这两个蛋白的活性阻断剂及疫苗对防治炭疽具有非常重要的意义。本研究对PA的显性抑制突变体的免疫原性和体内体外对炭疽致死毒素的抑制活性进行了研究;对具有转运活性的LF的N端携带外源抗原引发的细胞免疫反应和对免疫机体产生的保护力做了评估;筛选了毒力丢失的LF突变体,并对其毒力丢失机理进行了解释。主要研究内容如下:1.表达并纯化了具有生物学活性的炭疽保护性抗原PA和致死因子LF并应用于炭疽致死毒素作用的细胞模型成功克隆、表达、纯化了炭疽致死毒素蛋白PA和LF,通过对炭疽致死毒素敏感靶细胞RAW26.7的裂解致死作用,建立了评价炭疽致死毒素作用的微量细胞培养模型。该方法使用96孔板培养细胞,用alamarBlue荧光染料检测细胞存活率来评价毒素作用效果,灵敏度高,能用于检测毒性降低或丢失的炭疽致死毒素的突变体。利用该法检测纯化的PA和LF蛋白的生物学活性,当LF为1μg/mL时,可导致50%细胞死亡的PA浓度(EC₅₀)约为0.078μg/mL,当PA为1μg/mL时,可导致50%细胞死亡的LF浓度(EC₅₀)约为0.003μg/mL。细胞毒性实验表明本研究成功的纯化了生物学活性较高的炭疽致死毒素蛋白。2.筛选高显性抑制活性的PA第427位苯丙氨酸残基的饱和突变体用作炭疽毒素抑制剂和炭疽疫苗PA的第427位氨基酸是PA形成七聚体内孔并参与转运底物LF/EF的关键氨基酸位点。利用定点饱和突变技术将PA第427位苯丙氨酸突变为其他19种天然存在的氨基酸。将包括野生型PA（WPA）在内的20种PA蛋白进行表达纯化,利用炭疽致死毒素作用的细胞模型对PA突变体的活性进行筛选,得到了16株毒力完全丢失的PA突变体和3株毒力降低的PA突变体。将16株毒力丢失的PA突变体与WPA和LF混合后加入RAW264.7,筛选对炭疽致死毒素抑制活性最强的PA427突变体,结果表明在这些突变体中,苯丙氨酸突变为天冬氨酸（F427D）或突变为天冬酰胺（F427N）表现出了最强的显性抑制活性。将F427D和F427N分别与炭疽致死毒素混合后静脉注射小鼠,观察小鼠存活率及脾脏病理变化。当F427D:WPA=1:8时小鼠完全存活,当F427N:WPA=1:4时小鼠完全存活。说明这两株突变体在小鼠体内也表现出较强的抑制活性。炭疽致死毒素能引起小鼠脾脏肿大,增加突变体浓度小鼠的脾肿大现象也随之消失。当突变体与WPA为等比注射小鼠时,小鼠的脾脏重量完全恢复正常。当5μgF427D突变体混合炭疽致死毒素注射小鼠时,小鼠脾脏出现了明显的病理变化,表现为脾脏固有结构消失,红白髓界限消失,淋巴细胞大大减少。当突变体与WPA等量注射小鼠时,小鼠脾脏结构正常,红白髓结构正常,细胞密度正常,在脾小体中央出现生发中心,这是小鼠产生免疫反应的表现。在小鼠的免疫攻毒实验中,F427D和F427N均能较WPA激发较高的小鼠抗体滴度,且以Th2型免疫反应为主。免疫小鼠均能耐受5×LD₅₀的炭疽致死毒素的攻击,而PBS对照组的小鼠在静脉注射炭疽致死毒素24 h内均全部死亡。F427D和F427N对小鼠的免疫力保护主要与低浓度的IL-1β和高浓度的IgG1,IL-6和TNF-α相关。F427D和F427N作为炭疽毒素抑制剂和炭疽疫苗有良好的应用前景。3.LF的N端（1-254aa）携带2型猪链球菌表面抗原Sao进入细胞质并激发细胞免疫反应的研究LF的N端（1-254aa）是LF无毒的部分,它能携带与其融合表达的蛋白质和多肽进入细胞质中继而激发机体的细胞免疫反应。将LFn与2型猪链球菌表面抗原Sao融合表达为重组LFn-Sao蛋白。将LFn-Sao与炭疽致死毒素混合后加入RAW264.7细胞,固定野生型LF的浓度,随着LFn-Sao浓度的增加,细胞的存活率显著升高。这说明LFn-Sao能与LF竞争性的结合PA并被转运。LFn-Sao能较Sao激发更高的Sao特异性IgG抗体滴度,表现出较高的免疫原性。LFn-Sao免疫组的小鼠IgG2a与IgG1的比值比Sao免疫组的显著提高,而IgG1的抗体滴度与Sao的相当,表明LFn-Sao能增强免疫小鼠的Th1型免疫反应。用Sao蛋白分别刺激免疫小鼠的脾淋巴细胞,12 h后用流式细胞仪检测表达IFN-γ的CD8+的阳性率,72h后用定量ELISA试剂盒检测分泌至细胞外的IFN-γ量。结果显示LFn-Sao免疫组小鼠淋巴细胞再次遇到相同抗原刺激时表达IFN-γ的CD8+的阳性率和分泌到细胞外的IFN-γ的量均显著高于Sao单独免疫组小鼠。这表明LFn能增强融合抗原激发细胞免疫反应的能力。用5倍半数致死剂量的2型猪链球菌对免疫小鼠腹腔进行攻毒,LFn-Sao对免疫小鼠的保护力显著高于Sao单独免疫时对小鼠的保护力。4.无毒炭疽致死因子（LF）的筛选及其毒力丢失机理的研究PCR扩增LF基因时得到一株LF第236位酪氨酸突变为苯丙氨酸的突变体（Y236F）。细胞毒性实验结果显示,Y236F较WLF活性降低37000倍。Y236F不能与PA结合,不能通过与WLF结合竞争性的结合PA而抑制LF毒性。由于酪氨酸和苯丙氨酸的侧链非常相似,Y236F的活性大大降低说明LF与PA结合主要是靠其侧链的羟基与PA形成氢键结合的。Y236F用于免疫小鼠,第3次免疫后1周,小鼠的抗体滴度升高至1:819200,表明Y236F毒力丢失后仍保持很强的免疫原性。免疫血清1:20稀释仍然能100%保护细胞避免炭疽致死毒素的裂解。LF对底物MEK2的切割活性位点在第Pro10-Arg11之间。利用生物信息学分析得到LF中D328,F329和V653与MEK2第10和11位氨基酸距离最近,在3A以内。利用定点突变技术将以上3个氨基酸突变为丙氨酸,表达纯化这3株突变体蛋白,细胞毒性实验表明这3株突变体毒性均未降低。说明这3个氨基酸位点并非LF中与底物发生作用的关键氨基酸位点。LF对底物的切割活性与MEK2上的其它氨基酸位点相关。组氨酸是中性氨基酸,在体内的中性pH值下,其咪唑基即可游离出H⁺也可游离出OH^-离子,因此组氨酸在酶活性中发挥重要作用。LF的结构域2,3,4是LF与其底物结合的结构域,在这3个结构域中共有12个组氨酸。在这12个组氨酸中,H686到H690是已经报道的LF金属蛋白酶的Zn²⁺结合有关的序列（HEXXH）。H745到H749的结构为HSTDH,与HEXXH结构非常相似。对H745到H749进行定点饱和突变,并利用LF突变体高通量检测模型检测这些突变体活性。对每个突点位点,取150个克隆进行鉴定。结果表明H745发生突变的150个克隆中有35个克隆的活性完全丢失,而发生在其他4个位置突变的所有150个克隆均保持活性。分析LF的3D晶体结构发现H745-H749与Zn²⁺的距离均较远,其中H745与Zn²⁺的距离最近,但也与距离Zn²⁺ 13.6A。说明LF H745-H749不是LF的锌离子结合区域。将这3个结构域中剩余的8个组氨酸分别定点突变为丙氨酸,与PA混合后作用细胞,筛选这些突变体活性。其中H669A的细胞毒性完全丢失,蛋白浓度高至20μg/ml时细胞的活性也完全存活。H669A用10倍LF的半数致死剂量与PA混合后注射小鼠,小鼠完全存活,且脾脏不表现任何病理变化。与LF竞争性结合PA的实验结果显示,H669A能与PA结合。Western-blot结果显示H669A能被PA转运到细胞质中。将H669A和WLF用Chelex-100吸附除去溶液中的二价Zn²⁺后,用原子吸收光谱测定蛋白内的Zn²⁺含量。结果显示H669A和WLF中Zn²⁺的含量完全相同,并且LF的3D晶体结构模型也表明H669A与Zn²⁺的距离较远,为14A。这说明LF的第669位组氨酸既不是与PA结合的位点也不是稳定Zn²⁺的位点,而是与LF酶活性中心相关的关键氨基酸位点,H669突变后影响LF对底物的切割活性。