伊犁鹅繁殖周期卵巢发育关键基因挖掘及功能验证

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新疆伊犁鹅是我国唯一来源于灰雁的草食性特色地方家禽品种,其肉质优良、营养价值丰富,且具有适应性强、耐粗饲、抗病力和抗逆性强的特点,是发展地方特色养鹅业不可替代的品种资源。但作为一个地方鹅种,伊犁鹅的年产蛋数较少,并呈现明显的个体差异,其最高年产蛋量可达27枚,最低年产蛋量仅为1枚,平均年产蛋量为11枚,较低的繁殖效率严重制约了伊犁鹅产业的快速发展。卵巢与卵泡的发育是影响家禽产蛋性能的重要因素。鹅卵巢发育具有三个不同的生理阶段,分别是发育生长阶段、产蛋繁殖阶段以及休产阶段。在卵巢发育生长期间,原始卵泡被募集,且保持静止状态。在产蛋期间,卵泡被激活,排卵成为卵巢的主要活动,受到性激素分泌的调节。与产蛋期相反,母鹅的大多数生殖活动在休产阶段停止。鹅卵巢在三个生理阶段中表现的巨大差异,很大程度上受差异基因表达不同所致。因此研究卵巢组织在鹅产蛋各阶段转录水平上的表达特征,可为筛选鉴定调控鹅卵巢发育的关键基因,进而为提高鹅的产蛋性能提供重要依据。伊犁鹅是我国典型的季节性繁殖动物之一,在第三个产蛋年时进入产蛋高峰期,每年仅有1个产蛋周期,该特征也使得伊犁鹅成为研究鹅各产蛋周期基因表达模式的理想动物模型。因此,本研究以3岁的伊犁鹅母鹅为研究对象,在全转录组水平进行伊犁鹅产蛋前后各期(n=4/时期)卵巢组织的mRNA与非编码RNA的鉴定,结合生物信息学分析、RT-q PCR、双荧光素酶试验、Western blot、CCK-8及流式凋亡检测等技术,深入挖掘、鉴定影响鹅卵巢发育的关键基因与非编码RNA,为探索基因与非编码RNA介导鹅卵巢发育的分子调控机制提供理论基础。本研究的主要结果如下:(1)利用全转录组测序技术,揭示了产蛋前后各期伊犁鹅卵巢组织中的mRNAs与lncRNAs表达差异,与开产期组相比,产蛋期组分别有337个差异mRNAs和466个差异lncRNAs;与休产期组相比,产蛋期组中有1136个差异mRNAs和925个差异lncRNAs,开产期组中有525个差异mRNAs和742个差异lncRNAs;三个时期共有的差异mRNAs、差异lncRNAs分别有4个、6个。GO富集分析显示差异表达mRNAs与lncRNAs靶基因主要富集在生物调控、细胞过程以及代谢过程等条目;KEGG富集分析发现,差异表达mRNAs与lncRNAs靶基因主要显著富集在与卵巢发育相关的神经活性配体-受体相互作用、ECM-受体相互作用及类固醇生物合成等通路。此外,通过构建差异mRNAs的蛋白互作网络,筛选到与鹅卵巢发育相关的潜在调控基因BTK、PDGFRA和ITGB3等。(2)本研究从12个伊犁鹅卵巢组织中共鉴定了2700个known-miRNAs、2983个novel-miRNAs。与开产期组相比,产蛋期组有258个差异miRNAs;与休产期组相比,产蛋期组中有1131个差异miRNAs,开产期组中有909个差异miRNAs;三个时期共有的差异miRNAs有44个。GO富集分析显示,差异miRNAs靶基因主要与催化活性、细胞过程等相关;KEGG富集分析结果显示,差异miRNAs靶基因主要参与与产蛋过程相关的ECM-受体相互作用、钙信号通路与Notch信号通路等。基于上述数据,本研究建立并初步验证了一个参与卵泡发育,并与细胞增殖、分化和凋亡有关的差异lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,并通过实时荧光定量PCR技术验证了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络中关键节点的表达趋势。(3)本研究在伊犁鹅卵巢组织中共鉴定circRNA 4483个,与开产期组相比,产蛋期组有159个差异circRNAs;与休产期组相比,产蛋期组中有455个差异circRNAs,开产期组中有383个差异circRNAs。功能分析结果表明,各阶段卵巢组织中差异circRNA的来源基因多富集于生物调节、催化活性等生物学过程以及信号传导、代谢等相关通路。基于差异circRNA-miRNA调控网络,筛选到核心调控因子circRNA NW_013186107.1:36835|52574与gga-miR-34b-5p。(4)基于伊犁鹅各时期卵巢组织的差异lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,筛选并验证了MSTRG.5970.28、miR-133a-3p及ANOS1在休产期与产蛋期的表达趋势。经h CG(5 IU/m L)或FSH(10 IU/m L)处理鹅颗粒细胞后,发现颗粒细胞中MSTRG.5970.28的表达均极显著降低,说明MSTRG.5970.28可能参与了鹅卵泡发育过程的调控。通过双荧光素酶活性检测试验,发现MSTRG.5970.28与ANOS1存在miR-133a-3p的靶向性结合位点。此外,本研究发现,过表达miR-133a-3p均极显著抑制了MSTRG.5970.28与ANOS1在鹅颗粒细胞中的表达,干扰miR-133a-3p后二者的表达均极显著升高。通过CCK-8细胞增殖与流式凋亡检测试验,发现过表达MSTRG.5970.28可极显著抑制颗粒细胞的增殖、促进颗粒细胞的凋亡。相反,当干扰MSTRG.5970.28后,颗粒细胞的增殖能力极显著升高、凋亡率极显著降低,miR-133a-3p对颗粒细胞的增殖与凋亡的影响则与MSTRG.5970.28的作用相反。同时,本研究将过表达MSTRG.5970.28、miR-133a-3p质粒共转染至颗粒细胞中,发现由MSTRG.5970.28过表达引起的颗粒细胞的增殖与凋亡作用,会被miR-133a-3p所减弱。通过RT-q PCR及WB试验,发现MSTRG.5970.28可作为miR-133a-3p的ceRNA竞争性结合miR-133a-3p,从而减弱miR-133a-3p对ANOS1的抑制作用。综上所述,本研究构建了伊犁鹅不同时期卵巢组织的全转录组基因表达谱,揭示了各时期伊犁鹅卵巢组织中mRNAs、lncRNAs、miRNAs与circRNAs的表达差异,初步探索了差异表达mRNAs、lncRNAs、miRNAs与circRNAs参与伊犁鹅卵巢发育相关的信号通路,构建了ceRNA调控网络,发现并验证了网络关键节点MSTRG.5970.28可作为miR-133a-3p的ceRNA调控ANOS1的表达,影响鹅颗粒细胞的增殖与凋亡。本研究通过对伊犁鹅产蛋前后各期卵巢发育关键基因的挖掘及MSTRG.5970.28-miR-133a-3p-ANOS1的功能验证,为揭示鹅卵巢发育的分子机制,进而为提高鹅产蛋性能的研究奠定了理论基础。
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