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肠嗜铬细胞(Enterochromaffin cells,EC细胞)是肠道上皮中含量最多的一类内分泌细胞,其胞内含有合成5-羟色胺(5-HT)的限速酶,即1型色氨酸羟化酶(TPH1),可以合成分泌机体内95%以上的5-HT。在肠上皮中,EC细胞与肠道的免疫细胞互为近邻,二者可以通过5-HT、细胞因子及炎性介质的释放,形成交互调节的信号环路;另外,EC细胞还是肠道内的化学感受器,可以感受肠腔内微环境的变化,包括肠道菌群及其代谢产物的变化。由此可以看出,EC细胞可能在肠道炎症以及菌群-宿主互作中,具有非常重要的调控作用。HCN2通道(Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel2)是一类超极化激活的环核苷酸门控的阳离子通道,它可在膜电位复极化到接近静息电位,或者胞内c AMP浓度升高时被激活,诱发一个内向电流(Ih),从而调控细胞的兴奋性。我们通过免疫荧光染色的方法确认EC细胞表达HCN2通道,并利用伏安法实时检测肠道粘膜5-HT释放,验证HCN2通道参与调控肠道5-HT分泌,在此基础上,进一步探讨EC细胞HCN2通道在肠道炎症及菌群-宿主互作中的意义。主要实验方法和结果如下:一、EC细胞HCN2通道对肠道炎症的调控作用1.EC细胞上表达功能性的HCN2通道,而且在急性肠道炎症状态下,HCN2通道的表达水平和血清5-HT含量均显著上调我们分离培养原代肠嗜铬细胞,并通过全细胞膜片钳的方法记录到HCN2通道的电流。我们给小鼠连续饮用7天3%DSS,诱导急性肠炎模型,通过western blot和Elisa检测发现,肠炎小鼠结肠上皮中HCN2蛋白的表达水平比对照组小鼠显著增高,小鼠的血清5-HT含量也显著高于对照组。2.慢性肠炎模型小鼠结肠上皮HCN2蛋白表达显著上调,HCN通道的阻断剂Ivabradine促进小鼠肠道炎症的恢复我们通过给小鼠饮用0.5%和1%DSS诱导慢性肠炎小鼠模型,发现慢性肠炎模型小鼠结肠上皮HCN2蛋白的表达水平和血清5-HT的含量都显著高于对照组小鼠,其结肠上皮TPH1的表达也有显著提高。此外,给小鼠腹腔注射HCN通道阻断剂Ivabradine可以加快小鼠肠道炎症疾病活动指数的降低,促进小鼠血清5-HT含量的下降,表明Ivabradine能促进小鼠肠道炎症的恢复。3.炎症性肠病患者的血清5-HT含量显著增加,其结肠上皮HCN2蛋白的表达上调我们从医院收集了炎症性肠病患者的血清和肠道组织,通过western blot和Elisa检测发现,活动期患者血清5-HT含量显著高于健康志愿者,相比于正常部位,患者病变部位粘膜HCN2蛋白的表达水平上调,而且可能涉及炎症状态下HCN2通道的翻译后修饰。二、EC细胞HCN2通道在菌群-宿主互作中的调控作用1.青霉素和链霉素分别提高小鼠肠道上皮HCN2和TPH1的表达水平,且两者都可提高小鼠的血清5-HT含量我们考察了抗菌素所致肠道菌群改变对肠道5-HT分泌的影响。首先给小鼠饮用十天含青-链霉素的饮水(青霉素2 mg/ml,链霉素4 mg/ml),发现小鼠肠道上皮中HCN2的表达水平较对照组显著提高,相应地,血清5-HT含量也显著增加。分别给小鼠饮用十天含青霉素(2 mg/ml)或链霉素(4 mg/ml)的饮水,发现两组小鼠血清5-HT的含量均显著高于对照组,青霉素组小鼠肠道上皮中HCN2表达增加,而链霉素组小鼠肠道上皮中TPH1的表达升高,提示青霉素和链霉素分别通过提高HCN2和TPH1表达水平促进肠道5-HT释放。2.抗菌素处理引起盲肠增大和肠道动力改变青-链霉素组小鼠盲肠较对照组显著增大,单独给予青霉素或链霉素的小鼠盲肠也较对照组增大,且青霉素组比链霉素组盲肠增大更显著。另外,与对照组小鼠相比,青霉素组小鼠肠道传输时间显著延长,粪便含水量显著提高,而链霉素组小鼠只出现粪便含水量的提高。我们进一步发现,给予青霉素饮水的同时腹腔注射HCN阻断剂Ivabradine(20 mg/kg),能够降低青霉素组小鼠血清5-HT水平,并减轻青霉素所引起的盲肠增大、粪便含水量增加及肠道传输时间延长的现象。3.青霉素和链霉素引起肠道短链脂肪酸的差异性改变通过气相色谱-质谱联用法检测青霉素组和链霉素组小鼠盲肠短链脂肪酸的变化,发现相比对照组,青霉素组和链霉素组小鼠盲肠短链脂肪酸的总量都有显著降低,青霉素组丁酸、异丁酸和异戊酸降低较链霉素组更显著,但两组小鼠盲肠内丙酸含量增加。4.青霉素处理可引起认知行为变化我们对青霉素组小鼠进行行为学检测。三腔社交偏好测试中,青霉素组小鼠与陌生小鼠的交流频率比对照组小鼠更高,高架十字迷宫测试中青霉素组小鼠在开放臂停留时间比对照组小鼠缩短,刻板行为测试中青霉素组小鼠较对照组小鼠自发捋毛时间延长。使用HCN通道阻断剂Ivabradine,可部分逆转青霉素组小鼠的异常行为表现。以上结果表明,肠嗜铬细胞上的HCN2通道可驱动5-HT分泌,这一机制参与维持肠道炎症状态。抗菌素引起的肠道菌群结构改变,可能通过上调HCN2或TPH1表达而增加5-HT分泌或合成,因而HCN2通道在菌群-宿主互作中可能发挥重要作用。我们的研究结果提示肠嗜铬细胞的HCN2离子通道可能是炎症性肠病以及肠道菌群异常相关疾病的潜在干预靶点。