重组工程技术又称为λ-Red/ET同源重组技术,是一种利用重组酶催化DNA分子之间进行同源重组的技术。其中发挥作用的重组酶主要包括λ噬菌体的Redαβγ重组酶以及Rac前噬菌体的RecET重组酶。重组工程的突出优点是可对DNA分子的任何位点进行修饰,没有DNA片段的大小和限制性内切酶酶切位点的限制。寡核苷酸重组工程是指利用单链寡核苷酸为重组酶的底物,无须PCR或酶切所获得的双链DNA,因此最为简便快捷。CRISPR/Cas是在细菌和古细菌长期进化演变的过程中形成的一种获得性免疫防御系统。目前,来源于化脓链球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统的研究最为透彻,也是使用的最为广泛的基因编辑系统。Cas9可以通过crRNA的引导特异性的切割靶DNA,并且有着很高的编辑效率。大肠杆菌引发酶DnaG是DNA复制所必需的,研究者们发现DnaG K580A和Q576A单突变的菌株均能够提高重组效率。本研究组此前利用CRISPR/Cas9技术与寡核苷酸重组工程联合用于大肠杆菌基因组DnaG的编辑,成功地获得了Q576A和K580A的单突变菌株,以及Q576T K580A和Q576V K580A的双突变菌株。本文第一部分首先运用两步法对在突变过程中引入的两个功能质粒进行质粒消除,具体方法为构建自剪切质粒pLS3550,根据质粒不相容原理替代菌株中难以消除的cas9表达质粒pLS3535,再通过加入热灭活的氯四环素(cTc)诱导表达归巢核酸酶I-SceI,通过I-SceI酶切pLS3550和sgRNA表达质粒而消除这两个质粒。随后使用两种方法测定和比较了 DnaG突变菌株重组工程效率,包括基于双链DNA为底物的基因组上laZ’基因敲除以及基于单链DNA为底物修复pACYC-mkan所包含的失活的卡那霉素抗性基因。两种方法均表明大肠杆菌DnaG Q576T K580A双突变菌株大肠杆菌LS4019具有最高的重组工程效率。为进一步提高菌株的重组工程效率,本研究第二部分是在大肠杆菌DH10B△mutS菌株LS3508的基因组上进行recJ,sbcB,xseA,exoX基因敲除。各基因的功能为recJ基因编码5’→3’单链DNA外切酶,sbcB基因编码3’→5’DNA外切核酸酶,xseA基因编码外切核酸酶Ⅶ,exoX基因编码单链DNA外切核酸酶。将得到的敲除菌株以基于修复pLS4015所包含的失活的氨苄青霉素抗性基因的方法来比较重组工程效率。结果显示sbcB基因敲除菌株重组效率最高,达到13.8%。类似的,在LS4019基础上进行叠加敲除,以同样的体系进行菌株效率比较,但是发现其重组效率比未敲除的菌株效率低。我们已经构建了cas9表达质粒及redβ重组酶和cas9诱导表达质粒,拟将CRISPR/Cas9技术与寡核苷酸重组工程联合运用于质粒点突变的研究。本文第三部分是拓宽基因编辑适用范围的研究。首先构建含有受阿拉伯糖诱导的致死性基因ccdB以及PAM为NGG的质粒pLS4046以及PAM为NG的质粒pLS4047。这两种质粒在含有L-阿拉伯糖的LB固体和液体培养基中培养时,均不长或长出少量菌落,表明ccdB基因表达,产生了毒性并杀死细胞。随即对RNP(核蛋白)复合物的切割性能进行测试,构建了含有完整RNP复合物的、crRNA能够识别NGG的质粒pLS4043,及cas9基因的PAM识别区域为ccdB所取代的质粒pLS4044,以及含有完整RNP复合物的、crRNA能够识别NG的质粒 pLS4055 和 pLS4057。pLS4055 含有 Cas9 T1337R R1335V A1322R E1219F G1218RD1335V,pLS4057 比 pLS4055 多了 Cas9 L1111R。将构建的 4 个质粒分别转入含有pLS4046和pLS4047大肠杆菌感受态细胞中,在含有诱导剂L-阿拉伯糖和氯霉素的条件下进行筛选。结果表明pLS4043,pLS4055,pLS4057均能够切割NGG;pLS4055和pLS4057能够切割NG;而无Cas9活性的pLS4044不能发挥切割作用。这表明了 RNP识别NGG而不识别NG的体系是可行的。随后,通过易错PCR的方式对cas9基因进行点突变,以期能够拓宽其切割的靶向范围的突变体。在首次实验中,随机挑取8个克隆进行测序进行测序,结果显示8个克隆均发生了突变且突变位点随机分布,这为后续的突变和筛选实验奠定了基础。