木质素是植物次生细胞壁中含量仅次于纤维素的主要成份,对制浆效率、纤维素利用率和污染成本的控制具有极大的负面影响,从纸浆材生产需求出发,希望木材中的木质素含量更低或更易于去除。然而木质素在维持植物正常生长发育、防御病原菌侵害方面仍具有不可或缺的重要意义,木质素降幅过大对植物具有潜在的不利影响,所以定向调控木质素单体合成,提高其S/G比值,成为纸浆材品质提升的主要研究策略。F5H、COMT和CCoAOMT是催化G木质素单体向S木质素单体转化过程的三种关键酶。本研究对尾叶桉优良无性系GLU4中上述三个关键酶的编码基因进行克隆、鉴定,并研究了其单独及组合转化对烟草木质素单体合成的影响,为下一步尾叶桉木材品质转基因改良提供研究基础。采用同源序列设计引物通过RT-PCR方法获取EuF5H、EuCOMT、EuCCoAOMT基因序列,并将核酸序列在GenBank数据库检索比对,发现其分别与其它桉属植物中已报道的同类基因一致性极高,并且其基因结构与同类基因一致。DNA序列的结构域比对分析结果显示,分离到的基因片段中包含完整CDS,并且具有与基因功能相符的特征性结构域。对基因编码蛋白序列的理化性质、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、二级结构和三级结构预测分析结果,分别与推测的基因功能相一致。综合众多分析预测结果,证实了获取的基因序列具有极高的可靠性,完成了目标基因的生物信息学鉴定。目标基因在尾叶桉植株体内表达模式分析发现,三个基因表达模式基本一致,在半木质化茎中表达水平最高,嫩茎中其次,根系中表达量最低。将EuF5H、EuCOMT基因的正义片段与EuCCoAOMT的RNAi片段分别构建单基因植物表达载体,并利用双向表达载体构建了二价基因植物表达载体,通过农杆菌介导转化获得了转基因植株。对转基因植株中目标基因的表达水平进行了荧光定量PCR检测,发现转入的两个基因的正义片段可以正常表达,RNAi片段也如预期的强烈抑制了目标基因的表达。茎部结构切片观察结果显示,转基因植株茎部生长、细胞结构等表型与野生型无显著差异。木质素、纤维素含量以及茎部组织切片的木质部测量结果一致显示,与野生型相比,转基因植株的木质素含量和木质部厚度表现出轻微地改变。木质素单体检测结果反映出转基因操作显著的影响了单体合成,除EuCOMT正义片段的转化植株外,都达到了预期的S/G提高的调控效果,但调控幅度略有不同。总结参试植株的单体合成调控情况发现,在烟草中EuF5H的正义表达,促进了 S木质素的合成,并对G木质素合成有轻微的抑制作用;EuCCoAOMT的RNAi片段,对烟草S木质素的合成影响不大,但对G木质素的合成强烈的抑制效果;在烟草中正义表达EuCOMT,则在基本不影响S木质素合成的同时,提高了 G木质素的合成。同时发现,双基因共转化的植株,其木质素单体合成调控结果,并不是单基因转化效果的简单加成,有些甚至出现相反的趋势。在参试的3个双基因组合中,EuF5H正义片段和EuCCoAOMT的RNAi片段的组合表现出S木质素的大幅提高和G木质素的剧烈降低,S/G比值比野生型提高约3倍,说明F5H上调和CCoAOMT下调的调控方式对S/G比值的定向调控效果最佳。