福建是中国著名的产茶大省,主产茶类有绿茶、红茶、乌龙茶和白茶。茶叶中富含儿茶素、原花青素、黄酮或黄酮醇糖苷类化合物、茶氨酸(Theanine,Thea)、咖啡碱等次级代谢产物。相同茶树鲜叶原料经过不同加工工艺制成的不同茶类,代谢产物存在较大差异。揭示不同茶类差异代谢产物,探明加工对茶叶品质及功能活性物质形成的影响,对于茶叶加工工艺定向设计,开发对人类健康有益的茶产品具有实际参考应用价值。阿尔兹海默症(Alzheimer’s Disease,AD)是一种严重的神经退行性疾病,随着人类平均寿命提高,AD患者随之增加,这种疾病病程痛苦,护理成本高昂,给家庭、社会带来不幸和困扰。茶叶是具有保护神经细胞活性、防治AD潜力的重要天然产物,但是目前对不同茶类之间对神经细胞保护效果尚不清楚。明确不同茶类水提物及差异代谢产物对神经细胞大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(Rat Phaeochromocytoma,PC-12)的保护作用与作用机理,有利于茶叶资源的进一步利用,为茶叶天然产物多组分协同预防和治疗AD提供理论依据。为了阐明不同茶类工艺对茶叶功能品质影响的调控机制,探明茶叶对防治AD发挥的功能作用。本研究以相同鲜叶原料制成绿茶、乌龙茶、红茶和白茶4种茶类,应用代谢组学研究手段,探明不同茶类的差异代谢产物及其相对含量,以PC-12神经细胞为研究对象,研究了不同茶类的水提物及其差异代谢物的PC-12神经细胞保护作用与机理,主要研究结果如下:1基于靶向分析技术的不同茶类代谢物差异研究对相同原料制成的绿茶、乌龙茶、红茶和白茶主要代谢产物含量进行靶向研究可知,与鲜叶相比,不同茶类的儿茶素总量均降低。绿茶儿茶素总量最接近鲜叶,乌龙茶、白茶、红茶中梯度降低,白茶中非酯型儿茶素含量大幅降低,与红茶之间无显著差异,相对于鲜叶降低66.37%～74.04%;白茶中酯型儿茶素组分EGCG和ECG含量降低幅度小,接近于乌龙茶,相对于鲜叶降低5.19%和25.35%,显示白茶工艺独特的儿茶素组分转化模式。绿茶中的Thea、谷氨酸和天冬氨酸含量较高;乌龙茶中的谷氨酰胺、苯丙氨酸和色氨酸含量较高;红茶中除亮氨酸含量较高外,其余大部分氨基酸组分含量均较低;白茶中的大部分氨基酸组分含量均较高,另外,白茶的槲皮素-3-O-芸香糖苷(Quercetin-3-O-Rutinoside,Q-Rut)和咖啡碱含量比其他茶类高。2基于非靶向分析技术的不同茶类代谢物差异研究对相同原料制成的绿茶、乌龙茶、红茶和白茶进行非靶向研究,共筛选出381个差异代谢产物,鉴定出38个差异代谢物,其中包括6种儿茶素类组分和2种甲基化儿茶素、1种游离氨基酸组分、6种原花青素组分、12种黄酮或黄酮醇糖苷类组分、2种可水解单宁、5种酚酸类以及4种茶黄素组分。不同差异代谢物主成分分析图表明,鲜叶、绿茶和乌龙茶坐标距离最接近,而与红茶和白茶呈现三角分布。第一主成分负轴到正轴依次为鲜叶、绿茶、乌龙茶、白茶和红茶,第二主成分由负轴到正轴依次为白茶、鲜叶、绿茶、乌龙茶和红茶。不同茶类差异代谢物载荷图表明,第一主成分负轴与正轴所对应的差异代谢产物分别为儿茶素组分与茶黄素组分,代表了不同茶类的发酵程度,第二主成分负轴与正轴所对应的差异代谢产物分别为黄酮或黄酮醇糖苷组分与茶黄素组分,代表了白茶与红茶独特代谢物积累模式。绿茶经历杀青工序,保留较多儿茶素组分、甲基化儿茶素组分、Thea、可水解单宁、原花青素组分和绿原酸等物质;乌龙茶经历做青工序,其上述差异代谢产物略低于绿茶,原花青素组分、香豆酰奎宁酸、没食子酸、茶黄素组分部分积累;红茶经历发酵工序,香豆酰奎宁酸、没食子酸和茶黄素组分大量积累;白茶全程萎凋,黄酮或黄酮醇糖苷类物质保留量最多,酯型儿茶素组分、甲基化儿茶素组分也有一定程度保留,另外,非酯型儿茶素聚合形成茶黄素,没食子酸部分积累。3不同茶类水提物PC-12神经细胞的保护作用建立PC-12神经细胞β-淀粉样蛋白(Amyloid-Beta,Aβ)与氧化损伤模型,使用绿茶、乌龙茶、红茶和白茶水提物进行干预。结果显示,不同茶类水提物的安全剂量为100 μg/mL,高浓度(150 μg/mL)茶水提物对神经细胞活力不利,特别是绿茶、乌龙茶和白茶,其中红茶影响较小。在Aβ模型中,不同茶类水提物均显著提高神经细胞活力,恢复至正常细胞的95%以上,不同茶类处理之间无显著差异。在氧化模型中,不同茶类水提物均无法提高神经细胞活力。4不同茶类水提物抗Aβ缠结动力学荧光分析及异构化作用建立并应用硫黄素T(Thioflavin T,ThT)动力学荧光分析和透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy,TEM)法考察不同茶类水提物直接与Aβ作用效果。Tht结果表明,绿茶、乌龙茶、红茶和白茶水提物预后PC-12神经细胞均显著抑制Aβ缠结中β-折叠产生,荧光值全程低于300 RFU,且具有明显滞后β-折叠产生作用,总荧光值在5.5×103RFU以内,其中白茶水提物对β-折叠抑制效果最强,绿茶、乌龙茶和红茶次之。TEM结果表明,不同茶水提物预后细胞抗Aβ缠结形态差异明显,乌龙茶和红茶水提物处理仍保留Aβ缠结纤维状结构;绿茶处理纤维状结构消失,缠结颜色浅,厚度薄;白茶处理后Aβ缠结出现模糊结构,四周散状黑点,说明绿茶与白茶水提物抗Aβ缠结效果最好。5不同茶类差异代谢产物的PC-12神经细胞保护作用与机理为明确茶水提物神经细胞保护的作用与原理,选取不同茶类差异代谢产物进一步神经细胞保护效果研究,结果表明,表儿茶素(Epicatechin,EC)、茶黄素(Theaflavin,TFa)、山柰酚-3-O-葡萄糖苷(Kaempferol-3-O-Glucoside,K-Glu)、山柰酚-3-O-芸香糖苷(Kaempferol-3-O-Rutinoside,K-Rut)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Quercetin-3-O-Glucoside,Q-Glu)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Qaempferol-3-O-Rutinoside,Q-Rut)、伽马氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid,GABA)和Thea在100 μM浓度以内对PC-12神经细胞均安全,表没食子儿茶素(Epigallocatechin,EGC)、表儿茶素没食子酸酯(Epicatechingallate,ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechingallate,EGCG)和茶黄素-3’-没食子酸酯(Theaflavin-3’-Gallate,TFb)在高浓度下均对神经细胞活力不利,特别是 ECG。在 Aβ 细胞模型中,EC(50 μM和 100μM)、EGC(50μM)、EGCG(10μM和 50μM)、TFa(50μM 和 100μM)、TFb(10μM和 50μM)在均明显提高神经细胞活力,K-Glu、Q-Glu、Q-Rut可提高神经细胞活力但不明显,GABA和Thea则无作用。在氧化应激模型中,仅ECG可明显提高神经细胞活力,其他代谢产物则无作用或加剧神经细胞损伤。EC、EGC、ECG、EGCG、TFa、TFb、K-Glu、K-Rut、Q-Glu、Q-Rut均明显抑制Aβ缠结中β-折叠产生。其中ECG、EGCG、TFa和TFb效果最为明显,总荧光值与对照1.7×106 RFU相比降低至1.3×105 以内,ECG、Q-Rut、EC、K-Glu、K-Rut、Q-Glu 次之。EC、EGC、ECG、EGCG、TFa和TFb预后神经细胞的Aβ纤维缠结面积、密度、厚度均明显降低,EC、EGC和TFa处理下的Aβ形态相似,ECG、EGCG和TFb处理下Aβ形态相似,Aβ聚集形态产生较大改变。K-Glu、K-Rut、Q-Glu、Q-Rut预后神经细胞的Aβ缠结密度和面积略有降低。Thea、GABA预后神经细胞对降低Aβ缠结无明显作用。计算机模拟表明,EGC、ECG、EGCG、TFa均可与Aβ单体Lys16位点和Aβ寡聚体Lys28位点作用抑制Aβ缠结。