棉花是我国重要的经济作物之一,在农业中具有重要的地位,棉铃虫作为主要的棉花害虫之一,严重威胁棉花生产。Bt晶体蛋白是一种重要的生物杀虫剂,我国自1997年开始推广种植表达Bt杀虫蛋白的转基因抗虫棉后,棉铃虫种群数量得到了有效控制,取得了良好的经济效益和生态效益。但是随着种植范围的不断扩大,长期使用单一种类抗虫棉使得田间棉铃虫极易对Bt产生抗性,近年的田间监测结果显示棉铃虫对Cry1Ac的抗性有逐年上升的趋势,尤其是显性抗性等位基因频率上升较快。昆虫消化道是昆虫消化食物和吸收营养的重要器官,也是细菌、病毒及杀虫剂等毒物进入虫体的重要部位。许多研究已证实Bt毒素作用的靶标就是昆虫肠道,原毒素进入敏感虫体的肠道后,经过消化酶的作用转变为活化毒素,随后活化毒素和微绒毛上的特殊受体结合,导致虫体肠道形成穿孔、离子渗透压破坏,最终死亡。目前已有许多关于鳞翅目幼虫取食Bt毒素后的细胞学反应,结果显示Bt晶体蛋白能使柱状细胞发生显著损伤,同时也会引发中肠组织发生自我修复。但几乎所有的研究都仅仅针对敏感品系而言。本研究比较了棉铃虫敏感品系和具有不同机理的抗性品系幼虫在取食Cry1Ac毒素后的中肠反应,包括组织病理学、细胞凋亡以及增殖的异同,以期为棉铃虫Cry1Ac抗性机理研究提出组织病理学层面的证据。1.棉铃虫幼虫中肠细胞对Cry1Ac毒素的病理反应本研究从组织病理学的角度比较了棉铃虫敏感品系、隐性抗性品系和显性抗性品系在取食Cry1Ac毒素后的差别。结果显示,敏感品系SCD中肠细胞在取食毒素1～2 h后就表现出病理症状,如柱状细胞顶端膨大、长出囊泡,而后向肠腔脱落,最终发生液泡化,中肠组织无法维持原有形状;隐性抗性品系SCD-r1由于缺少重要受体钙粘蛋白,中肠细胞仅仅是生出芽状囊泡,极少数发生脱落,12 h后中肠细胞和组织便完全恢复正常;使我们意外的是显性抗性品系AY2在取食Cry1Ac毒素后也和敏感品系一样表现出相似的病理症状,但不同的是,12 h后AY2品系的中肠细胞基本恢复正常。显然,AY2品系在取食毒素后的12小时内,中肠组织发生了快速的自我修复。对取食Cry1Ac毒素6 h的SCD和AY2品系中肠进行病理学检测,发现两者的肠干细胞都会发生增殖分化,不同的是前者无法修复毒素造成的破坏而最终死亡,后者却能成功恢复正常,这可能和抗性品系干细胞增殖分化能力增强有关。上述结果表明了肠干细胞修复功能在Bt抗性机理中的重要作用,但具体如何发挥作用还需进一步的探究。2.Cry1Ac毒素对棉铃虫幼虫中肠细胞的凋亡和增殖反应组织病理学的结果显示,棉铃虫在取食Cry1Ac毒素后不仅会造成一系列病理变化,还可能发生细胞凋亡,并会促使肠干细胞增殖分化。此外,显性抗性品系AY2在取食毒素后的中肠细胞病理症状充分说明了中肠组织自我修复能力在抗性形成中的重要作用。因此,为了进一步证实Cry毒素是否能造成细胞凋亡以及肠干细胞增殖和分化能力在抗性形成中的作用,本研究对取食毒素后的细胞分别进行TUNEL检测和BrdU检测。TUNEL染色的结果显示,棉铃虫五龄初期的幼虫中肠在正常情况下不发生显著凋亡,但当取食Cry1Ac毒素后,各品系均会发生不同程度的凋亡,尤其是敏感品系SCD和显性抗性品系AY2。取食毒素2 h后,靠近肠腔的部分柱状细胞开始发生凋亡,6 h后这些凋亡细胞脱落至肠腔,细胞核变大。12 h后,SCD品系幼虫的肠壁细胞层间隙明显增大,个别细胞核较大的成熟细胞TUNEL染色呈阳性信号;而AY2品系的肠壁细胞基本恢复正常,没有发现凋亡细胞。BrdU染色的结果显示,棉铃虫五龄初期的幼虫中肠在正常情况下,肠干细胞发生轻微增殖,这可能是正常的生理活动。但当取食Cry1Ac毒素后,敏感品系SCD和显性抗性品系AY2幼虫肠干细胞都发生明显增殖,隐性抗性品系SCD-r1的阳性信号较弱,说明其发生增殖的程度相对较弱,TUNEL检测的结果显示SCD-r1的凋亡程度也相对较弱,因而可以推测细胞凋亡可能促使了肠干细胞的增殖。对SCD和AY2的干细胞增殖情况进行初步比较发现,AY2品系增殖的干细胞数量相对较多,说明干细胞增殖和分化能力的加强可能导致抗性的产生。