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随着我国卷烟和烟叶市场国际化程度的逐步加深,以及人们对健康意识的加强,人们对卷烟安全性的要求不断提高。开发“高香气、低焦油、低危害”的产品成为中式卷烟发展的方向。微生物能通过分泌生物酶降解烟碱等有害成分,并促进烟叶致香成分前体的转化,改善烟叶的吸食品质,因而日益受到研究人员的重视。目前报道的降烟碱微生物较多,但对微生物降解烟碱的代谢途径和相关的分子机制了解较少,制约了微生物在烟叶加工中的应用。本文从烟草栽培土壤中筛选得到一株具有较高烟碱降解能力的细菌。为探索该细菌的降烟碱特性和改善烟叶品质的潜力,本文主要开展了以下两个方面的研究工作:1.降烟碱细菌的分离、鉴定及Y22菌株烟碱代谢途径的研究;2.红球菌Y22菌株休止细胞降解烟碱特性及其对烟叶中烟碱的降解研究。
从6个烟叶样品和2个土壤样品中共分离得到3株具有较高降解烟碱能力的菌株,经过复筛得到2株有稳定降解烟碱活性的菌株Y22和Y23,其中Y22由16SrDNA序列、形态学和生理生化性质鉴定属于红球菌属,该属目前还没有烟碱降解的相关报道,所以选取Y22菌株作为后期实验的出发菌株。
Y22菌株降解烟碱的能力受到多种因素的影响,实验结果显示Y22菌株适宜的培养温度、pH和烟碱浓度分别为28℃、pH4.0~7.0和1.5 g/L。
用HPLC和TLC方法对红球菌Y22菌株烟碱代谢产物进行检测和分析,并用柱分离和制备型TLC方法对烟碱的代谢产物进行分离。对分离出的产物I用NMR、EI-MS和UV光谱进行鉴定,产物II用NMR、EI-MS、UV光谱和傅里叶变换红外光谱进行鉴定。经鉴定产物I为6-羟基烟碱,产物II为5-(3-Methyl-[1,3]oxazinan-2-ylidene)-5H-pyridin-2-one是一种新的烟碱代谢产物。产物Ⅲ用文献报道的方法进行分离,根据前人的文献和产物的形态特征初步判断产物Ⅲ为烟碱蓝。根据本文的研究结果和前人的文献报道对红球菌Y22菌株中烟碱的代谢途径进行了推测。
由红球菌Y22菌株制备的两种休止细胞(烟碱诱导型和非诱导型休止细胞)都能有效降解纯烟碱,其中烟碱诱导型休止细胞的烟碱降解能力高于非诱导型细胞。根据实验结果我们推测两种休止细胞降解烟碱的途径可能是相同的。
红球菌Y22菌株烟碱诱导型休止细胞可以有效地降解烟叶中的烟碱,但降解过程受水分含量的影响较大。
以上实验结果说明红球菌Y22菌株能有效降解烟叶中的烟碱,在烟叶的降焦减害和加速醇化过程中具有潜在的应用价值。
本论文的创新性主要体现在以下方面:
(1)从烟草栽培土壤中筛选得到一株降烟碱细菌,根据形态学特征、生理生化性质和16S rDNA序列把该细菌鉴定为红球菌Y22菌株,并首次对红球菌的降烟碱能力进行了报道。
(2)对红球菌Y22菌株的烟碱代谢产物进行了分离和鉴定,首次对红球菌降解烟碱的代谢途径进行了推测。