论文部分内容阅读
支架植入作为狭窄性血管疾病的主要治疗手段,支架植入后的新生内膜形成对术后的恢复是至关重要的。然而临床上针对支架植入后的再狭窄主要采用的是抑制细胞增殖的药物治疗,在抑制增殖的同时会伴随着新生内膜修复延迟。支架植入后血管平滑肌细胞（VSMCs）是新生内膜中参与损伤修复的主要细胞,因此阐明VSMCs在损伤修复中的细胞分子机制可能有助于指导支架植入后的术后治疗。目前已知骨髓来源的巨噬细胞是血管损伤修复中被招募的主要炎症细胞,它们被招募后对VSMCs的最终命运的机制研究仍不清楚。因此,本研究旨在探究VSMCs对支架植入后新生内膜修复的细胞分子机制,为加速支架植入后新生内膜修复的治疗提供重要的理论基础,帮助改善支架植入后血管修复的临床治疗效果。本研究的主要发现如下:1.基于大鼠腹主动脉316L金属裸支架植入模型,发现支架植入后新生内膜中VSMCs发生去分化。En-face免疫荧光染色可观察支架植入后1周c-KIT阳性细胞和巨噬细胞在支架植入段血管的远心段支架丝周边聚集。进一步免疫组化染色检测新生内膜中Mac-2（Total galactose-specific lectin 3,总巨噬细胞标记物）和Ym-1（M2巨噬细胞标记物）表达,可以观察到支架植入后1周大量巨噬细胞被招募到支架丝周边,尤其以M2巨噬细胞为主。支架植入4周后,巨噬细胞比例减少,新生内膜中依旧有着M2巨噬细胞。此外,新生内膜中VSMCs表达干细胞标志物c-KIT,表现为向干细胞样细胞去分化的潜能。2.体外构建VSMCs和巨噬细胞Transwell共培养模型,证明M2巨噬细胞可导致VSMCs发生去分化。首先,对共培养后VSMCs的形态,骨架以及细胞硬度进行比较,发现巨噬细胞可导致VSMCs由长梭形向多边形转变,骨架发生解聚,并且其硬度降低。进一步,分析VSMCs是受到巨噬细胞哪种因素的影响?通过对巨噬细胞分泌炎症因子的筛选可排除炎症因子的影响,进而用DII标记巨噬细胞后可发现下室VSMCs中有DII阳性膜结构被摄入。对M0、M1、和M2巨噬细胞分泌微囊泡进行DIO、DII和DID荧光标记后在VSMCs中的选择性吞噬,可以发现VSMCs更倾向于摄入M2巨噬细胞分泌微囊泡。通过q PCR、免疫荧光染色和Western blot等实验,发现VSMCs在和巨噬细胞共培养后高表达干细胞标记物c-KIT,平滑肌细胞标记物SM22α和α-SMA表达下调。为了验证M2巨噬细胞导致VSMCs去分化是否由外泌体介导,使用外泌体合成/分泌抑制剂GW-4869（10μM）抑制巨噬细胞分泌外泌体后,M2巨噬细胞对VSMCs去分化的现象受到抑制。3.M2巨噬细胞外泌体（M2Es）可导致VSMCs发生去分化。利用超高速离心法富集M2巨噬细胞分泌外泌体,透射电镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NTA）和Western blot发现外泌体直径在50-130 nm,呈碗状双层膜结构,表达CD63,Alix和Tsg101。同时,17 nm纳米金标记后的M2Es可被VSMCs有效摄入。与Transwell共培养模型结构一致,M2Es可导致VSMCs由长梭形向多边形转变、骨架发生解聚且可降低VSMCs硬度。通过q PCR、免疫荧光染色和Western blot等相关分子检测技术,发现VSMCs在摄入M2Es后高表达c-KIT,而SM22α和α-SMA表达下调。同时,M2Es可促进VSMCs的早期迁移和增殖。加入外源性M2Es可以加速支架植入后新生内膜中VSMCs发生去分化,新生内膜修复加速,招募更多M2巨噬细胞,且加速新生内膜中细胞增殖。4.转录组测序结果显示VSMCs的MAPK/AP-1信号通路被M2巨噬细胞外泌体激活。热图分析和q-PCR验证都证明VSMCs在M2巨噬细胞刺激后发生去分化且MAPK/AP-1信号通路激活。体内发现M2Es刺激后新生内膜中AP-1高表达。体外T-5224抑制AP-1活性后,M2Es对VSMCs去分化的影响受到抑制,同时VSMCs的骨架解聚和增殖加剧也受到抑制。综上所述,本课题研究发现了M2巨噬细胞通过外泌体调控VSMCs去分化促进支架植入后再内皮化;揭示了M2Es诱导支架植入后新生内膜修复的新机制:M2巨噬细胞→外泌体→MAPK/AP-1信号通路途径导致VSMCs的去分化。