团头鲂骨骼肌损伤修复的转录组分析和验证

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骨骼肌是动物机体最有可塑性和运动性的组织,而骨骼肌的生长发育与肌肉卫星细胞增殖、分化密切相关。很多研究表明,卫星细胞增殖、分化是一个复杂的调控网络。肌肉损伤后再生会引起肌发生和肌肉生成,为了解鱼类肌肉发育的调控机制,本研究以团头鲂幼鱼为研究对象,构建团头鲂肌肉损伤模型,并通过免疫组化、免疫荧光以及转录组测序等方法研究肌肉损伤修复的分子机制,筛选出与骨骼肌重塑及发育相关的基因,进行功能验证。主要研究结果如下:(1)通过石蜡切片HE染色,发现未损伤的对照组肌肉组织呈管状结构,肌纤维排列正常;观察48、144、216 hpi的组织病理学结构,发现损伤部位肌纤维明显断开,且重度损伤范围比轻度损伤的更大。随着修复时间的延长,损伤部位逐步变小,有新的肌纤维生成,肌肉骨架重新组合。(2)通过免疫荧光来观察Pax7+(Pax7-positive)卫星细胞在损伤部位是否被激活。结果表明,与对照组相比,损伤部位出现大量Pax7的阳性信号,说明肌肉损伤后卫星细胞确实发生了增殖。从绿色荧光蛋白的强弱来看轻损在96~144 hpi(hours post-injury,hpi)间达到高峰,而重损在48~144 hpi间达到峰值,而在216 hpi Pax7的阳性信号相对较弱。(3)重损、轻损与对照组转录组分析共鉴定出6729个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),其中上调表达2125个,下调表达4604个。GO富集分析显示DEGs显著富集于细胞间的连接、蛋白的信号转导以及酶的活性等;KEGG富集分析显示富集于肌动蛋白骨架调节、EB病毒感染以及粘着斑通路DEGs的数量最多,且大多数通路都与免疫、代谢以及细胞间分子有关。重损与轻损间的DEGs显著富集于疾病、机体的系统及信号转导等相关通路。(4)蛋白互作网络显示肌动蛋白骨架相关基因在整个细胞骨架网络中十分关键,说明肌纤维的合成与肌动蛋白调节息息相关;而脂质代谢通路中,糖类代谢相关通路显得十分重要。加权基因共表达网络共鉴定出5个共表达模块,进一步GO和KEGG富集分析显示,在Brown模块中有大量与肌肉发育和物质代谢相关通路显著富集;对Brown模块进行可视化分析发现,肌球蛋白相关基因mylpf、myl、myh等,与脂质和糖代谢相关的基因如pgm1、pfkma、pfkmb等在整个网络中处于很重要的位置。(5)筛选出与肌动蛋白骨架相关的下调基因cfl1(Cofilin1,cfl1),利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼cfl1基因突变体,该突变体缺失了2个碱基。
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