论文部分内容阅读
细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)是生物体为维持内环境稳定而产生的一种特殊的细胞死亡机制,是基本的生物学现象。PCD过程由多种基因控制,此类基因在多种动植物之间都非常保守。抗细胞凋亡基因(Defender against Apoptotic Death,DAD)就是其中之一。该基因编码寡糖基转移酶(OST)复合物中的一个亚基,是内质网中催化N-糖基化的主要核心成分,负向调控PCD过程的进行,在植物正常发育和抵御各类胁迫中发挥作用。本课题组前期的研究发现,在异源四倍体陆地棉(Gossypium hirsutum L.,基因组为AADD)中,DAD基因由于多倍化和选择性剪接等原因共产生3个转录本,分别命名为Dt1,Dt2和At,这3个转录本间具有明显表达分化。为了进一步揭示这3个转录本在陆地棉内的并存方式和抗凋亡机制,本研究从蛋白互作的角度,对陆地棉DAD基因3个转录本编码蛋白的互作谱进行了初步筛查,主要结果如下:1、成功构建了3个转录本的诱饵载体以异源四倍体陆地棉叶片组织的cDNA为模板,利用特异性引物与分子克隆技术得到了Dt1、Dt2和At转录本的编码区全长序列;分别构建了用于酵母双杂交的诱饵载体Dt1-p GBKT7、Dt2-p GBKT7和At-p GBKT7;诱饵载体转化Y2H Gold菌株后酵母生长结果表明这3个转录本编码蛋白均对酵母细胞无毒性且无自我激活活性。2、成功构建了酵母双杂交cDNA表达文库以陆地棉的叶片、花和棉纤维组织为样品,构建了一个用于蛋白互作网络筛选的高质量c DNA表达文库。初级文库库容量大于2.6×106 cfu,平均插入片段长度大于1.0 kb,百万级扩增文库质粒浓度为1.0 mg/m L。3、初筛3个转录本编码蛋白的互作蛋白诱饵载体Dt1-pGBKT7、Dt2-pGBKT7和At-pGBKT7分别与cDNA表达文库共转化Y2H Gold菌株。共转化效率在7.15×104-1.25×105 cfu/μg之间。通过酵母菌落PCR和测序鉴定,初步筛选到与Dt1互作的蛋白5个,与Dt2互作的蛋白4个,与At互作的蛋白3个。筛选到的蛋白中有5个蛋白分别参与植物体内不同组织关于PCD调控的机制,另外发现DUF538 family protein能够与Dt1和Dt2互作。而Dt1、Dt2与At转录本编码蛋白之间目前还未筛选到共享互作蛋白。这暗示陆地棉DAD基因的3个转录本可能参与不同的代谢途径并出现功能分化。