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研究目的1-溴丙烷(1-bromopropane,1-BP),又名正溴丙烷,溴代正丙烷等,是一种无色透明的有机溶剂,可通过正丙醇与氢溴酸或溴化钠反应得到。1-BP具有易挥发、不易燃、对臭氧层破坏小以及在空气中的半衰期短(17.5天到24天)等特点,因此从20世纪90年代1-BP逐渐成为消耗臭氧层物质(ozone depleting substance, ODS)如氟利昂类的替代剂。1-BP也被广泛应用于药物、杀虫剂、芳香剂和其它化学试剂制造的中间体；还作为脂肪、树脂、石蜡的溶剂和一些精密电子仪器的清洗剂。中国是1-BP主要生产国,2008年的年产量就达到了20,000吨,其中约五分之二用于出口。随着1-BP需求量的不断增加,1-BP接触和使用的人群也在不断扩大。流行病学调查和实验研究都观察到1-BP能够引起中枢神经系统(central nervous system, CNS)和周围神经系统(peripheral nervous system, PNS)异常。有研究证实CNS的异常早于PNS。从1999年美国报道了第一例1-BP职业中毒患者之后,各国1-BP中毒病例也相继报道,我国也已发现1-BP中毒患者。目前1-BP神经毒性的确切机制不清,临床上也没有治疗1-BP神经中毒的特效药物。动物实验观察到1-BP能够明显减少实验动物大脑内还原性谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量,产生氧化应激。体外实验观察到1-BP能够激活巨噬细胞内的核因子-κB(nucler factor kappa B,NF-κB),但1-BP是否能够激活CNS的NF-κB,以及NF-κB的激活是否与1-BP的神经毒性相关尚未报道。因此在本实验研究中,我们首先观察了1-BP染毒后大鼠大脑内GSH的变化,并观察了大脑中氧化应激感受器NF-κB和Nrf-2的激活情况,及NF-κB下游炎性因子的应答变化和Nrf-2下游Ⅱ相酶γ-谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase, GCL)和谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)的变化。在1-BP染毒同时给予NF-κB抑制剂-吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC),观察动物神经行为学改善、大脑中GSH的变化以及NF-κB和Nrf-2的激活情况,推断NF-κB在1-BP致大鼠中枢神经系统毒性中的作用,探讨1-BP致中枢神经系统损伤的机制,以期为1-BP的预防和临床治疗提供可以借鉴的依据。研究方法1.实验动物分组和处理：60只雄性Wistar大鼠(220-240g)适应性喂养5天后随机分成4组,即对照组、1-BP染毒组、PDTC+1-BP组以及PDTC对照组,每组15只。1-BP染毒组和PDTC+1-BP组每天经口给予800mg/kg·bw 1-BP,对照组和PDTC组每天灌胃等体积玉米油,灌胃体积均为2 ml/kg·bw。PDTC组和PDTC+1-BP组每天经腹腔注射剂量为100mg/kg·bw的PDTC;对照组和1-BP组每天注射同等体积的生理盐水,注射体积为5ml/kg·bw。连续给予13天,其中从第8天到第13天每组随机取10只大鼠进行Morris水迷宫实验。水迷宫实验结束后动物断头处死,在冰上迅速剥离大脑皮层,液氮速冻后置于-80℃冰箱待后续实验检测。每组剩余5只大鼠进行心脏灌注,制备冰冻切片用于后续研究。2.Morris水迷宫试验：从第8天开始每组随机取10只大鼠进行连续6天的Morris水迷宫试验(第一天为训练,数据不记录),记录40只大鼠的学习能力包括游泳总路程、逃避潜伏期,以及空间记忆指标-穿越平台次数。3.免疫组化检测：制备各组动物大脑的冰冻切片,然后采用免疫组化检测各组大鼠大脑前额叶皮质的神经元、小胶质细胞以及星形胶质细胞的形态和数目变化。4.氧化应激指标的检测：采用试剂盒分别检测大脑前额叶皮质GSH、GSSG含量,计算GSH/GSSG的比值,并检测γ-GCL和GR的活性；检测大脑内一氧化氮(nitricoxide,NO)的含量和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)的活性变化。5.Western blot检测：检测大脑前额叶皮质中脂质过氧化物4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)、γ-GCL、NF-E2相关因子2(transcription factor NF-E2-related factor-2,Nrf-2)、NF-κB、磷酸化的NF-κB的表达。6.炎性因子检测：采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测各组大鼠大脑皮层前额叶皮质肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukine-1β, IL-1β)的变化。结果1.1-BP和PDTC对大鼠神经行为学的影响：与对照组相比,1-BP染毒组大鼠游泳总路程延长(P<0.05)、逃避潜伏期时间增多(P<0.05),穿越平台次数减少(P<0.05)。与1-BP组相比,PDTC+1-BP组大鼠游泳总路程明显缩短(P<0.05)、逃避潜伏期时间减少(P<0.05),且穿越平台次数显著增多(P<0.05),提示1-BP能够损伤大鼠的学习和记忆能力,抑制NF-κB激活可以有效的改善实验动物的学习记忆能力障碍。Morris水迷宫试验显示各组大鼠的游泳平均速度无明显差异(P<0.05),排除了混杂因素的干扰。2.1-BP和PDTC对大脑GSH的含量的影响：与对照组相比,1-BP染毒组大鼠大脑前额叶皮质中还原型GSH含量明显减少(P<0.05),氧化型GSSG含量增多(P<0.05), GSH/GSSG的比值降低(P<0.05)。与1-BP组相比,PDTC+1-BP组大鼠大脑前额叶皮质GSH含量增加(P<0.05),氧化型GSSG含量减少(P><0.05), GSH/GSSG的比值升高(P<0.05),提示1-BP能够导致机体产生氧化应激,消耗大脑内的GSH,阻断NF-κB激活也有效改善实验动物大脑的氧化还原状态。3.1-BP和PDTC对大脑Nrf-2激活的影响：与对照组相比,1-BP组大脑前额叶皮质胞浆内Nrf-2含量增加并且核转位增强(P<0.05),下游Ⅱ相酶GR、γ-GCL的蛋白含量增加,但酶活性明显降低(P<0.05)。PDTC+1-BP组与对照组相比,胞浆内Nrf-2含量和核转位也明显增强(P<0.05),下游Ⅱ相酶GR. y-GCL的蛋白含量增高,其中酶活性与1-BP组相比明显增高(P<0.05)。提示1-BP能够激活大脑内Nrf-2通路,使Ⅱ相酶表达增加,启动机体的防御机制。但1-BP暴露后,与蛋白质水平含量增加相关,GR、γ-GCL的活性却明显降低。抑制NF-κB激活可使GR、γ-GCL的活性得到恢复。4.1-BP和PDTC对大脑氧化修饰蛋白的影响：与对照组相比,1-BP组大脑前额叶皮质内氧化修饰蛋白4-HNE和MDA的含量增高(P<0.05); PDTC+1-BP组与1-BP相比,4-HNE和MDA的含量降低(P<0.05)。提示1-BP升高大脑内氧化修饰蛋白的含量,抑制NF-κB激活可以有效改善实验动物脑内的氧化失衡。5.1-BP和PDTC对大脑内NF-κB激活的影响：与对照组相比,1-BP组大脑前额叶皮质胞浆和胞核内NF-κB蛋白含量均增高(P<0.05),而且NF-κB的核转位增强(P<0.05)；炎性因子TNF-α、IL-1β的含量也显著升高(P<0.05),NO含量增多(P<0.05)、诱导型一氧化氮合成酶(inducible NOS, iNOS)活性升高(P<0.05)。PDTC+1-BP组与1-BP组相比,大脑胞浆内NF-κB和胞核内蛋白含量均明显减少(P<0.05), NF-κB核转位减弱(P<0.05),炎性因子TNF-α、IL-1β的含量减少(P<0.05),NO含量减少(P<0.05)、iNOS活性降低(P<0.05)。提示1-BP能够激活NF-κB,并导致其下游炎性因子分泌增多和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)增多；阻断NF-κB激活可有效抑制炎性因子和RNS的产生和释放。6.1-BP和PDTC对大脑胶质细胞和神经元的影响：与对照组相比,1-BP暴露后,小胶质细胞和星形胶质细胞活化明显,1-BP组大脑前额叶皮质神经元数目也明显减少(P<0.05)。PDTC+1-BP组与1-BP相比,神经元数目增加(P<0.05),小胶质细胞和星形胶质细胞活化被明显抑制。提示1-BP能够导致大脑内炎性反应,并导致神经元损伤；阻断NF-κB激活、抑制脑内炎性反应,可有效逆转1-BP对大脑的损伤。结论1.1-BP可使实验动物大脑内小胶质细胞和星形胶质细胞激活、神经元丢失,大鼠学习记忆障碍。2.1-BP可导致实验动物脑内胶质细胞NF-κB激活,阻断NF-κB活化可有效逆转1-BP导致的实验动物中枢神经系统损伤,1-BP导致的脑内炎性反应与1-BP的神经毒性密切相关。3.1-BP暴露可激活脑内的Nrf-2通路,Nrf-2激活可能是大脑对1-BP神经毒性的代偿反应。