论文部分内容阅读
研究目的1-溴丙烷(1-Bromopropane,1-BP)是一种高挥发性有机化合物,在大气中的半衰期约为15天,存在时间短。在中纬度地区,1-BP臭氧消耗潜能(ozone depleting potential, ODP)较低约为0.013-0.018,故可作为臭氧消耗物质(ozone-depleting solvents, ODS)如氯氟烃(chlorofluorocarbons, CFCs)和氢氯氟烃(hydrochlorofluorocarbons, HCFCs)的替代物使用。1-BP用于清洗金属、塑料、电子和光学元件,还可作为脂肪、蜡和树脂的溶剂,也是生产杀虫剂、季胺类化合物、药物和香料的中间产物。在人类病例和动物实验中,1-BP均能够引起周围神经系统(peripheral nervous system, PNS)感觉和运动障碍,以及中枢神经系统(central nervous system, CNS)毒性如记忆损伤、疲劳和抑郁等。研究发现CNS症状的出现早于PNS,而且记忆损伤可以作为CNS毒性的指标并在动物实验中可以通过Morris水迷宫进行准确测量。所以通过记忆损伤研究1-BPCNS毒性的剂量反应关系、可能涉及的毒性机制和生物标志物对于1-BP中毒的早预防、早发现、早治疗具有重要意义。对以记忆损伤为症状的神经退行性疾病如阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的研究发现,氧化应激与记忆损伤可能具有病因学联系。在CNS,谷胱甘肽(glutathione, GSH)是主要的抗氧化剂,对活性氧(reactive oxygen species, ROS)和外源化合物的解毒起到了重要的作用。因此,稳定的GSH含量利于维持正常CNS功能,GSH耗竭可能导致记忆损伤。脑红蛋白(neuroglobin, Ngb)是新发现的存在于大脑中的内源性抗氧化剂,具有神经保护作用,与认知功能密切相关。Ngb含量和神经保护作用的发挥也依赖于细胞内氧化还原稳态。记忆功能依赖于神经元的完整,记忆丧失往往伴随着神经元的损伤和丢失。神经元的功能与星形胶质细胞联系紧密。氧化损伤能激活星形胶质细胞,激活状态的星形胶质细胞会释放炎性介质和ROS作用于神经元并最终导致神经元的死亡。ROS、前炎性因子如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-a, TNF-a)等都是星形胶质细胞的激活剂。本课题使用0,100,200,400,800mg/kg bw 1-BP对大鼠进行染毒,观察在1-BP致记忆损伤的过程中大脑皮层内侧前额叶皮质(medial prefrontal cortex, mPFC)病理、Ngb含量、GSH代谢、星形胶质细胞的变化及其与1-BP染毒剂量的关系,并通过基准剂量法寻找1-BPCNS毒性中较敏感的效应标志物,探讨氧化应激和神经炎症在1-BP致CNS毒性中的作用。方法1.动物处理：雄性Wistar大鼠(180-220g)85只,经5d适应性喂养,大鼠被随机分为5组(n=17),分别为对照组和1-BP染毒组(染毒剂量分别为100、200.400.800 mg/kg bw)。1-BP使用玉米油稀释,大鼠经灌胃连续给予1-BP 12d,对照组给予等体积玉米油,灌胃体积为0.2 ml/100g bw。实验第13d断头处死大鼠(每组10只),迅速剥离大脑皮层,放于-80℃待测；每组7只大鼠进行心脏灌注,制备石蜡和冰冻切片。2.大鼠认知功能测定：染毒第8d至12d,大鼠进行Morris水迷宫测试。定位航行试验中逃避潜伏期和游泳路程能够表现大鼠学习能力,空间探索试验中穿越平台次数和目标象限时间百分比可以反映大鼠记忆能力。3.大鼠mPFC神经元数量检测：免疫组化染色检测神经元标志蛋白NeuN,选取mPFC边缘前区(prelimbic area, PL)进行神经元计数。4.大脑皮层氧化应激指标：试剂盒检测GSH、氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG)、谷氨酸半胱氨酸连接酶(glutamate cysteine ligase, GCL)活性；western blot检测脂质过氧化标志物,如4-羟基-2-壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)和n-epsilon-己酰-赖氨酸(n-epsilon-hexanoyl-lysine, HEL)的蛋白质加合物；western blot检测Ngb含量变化。5.大脑皮层星形胶质细胞激活情况：免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein, GFAP)(激活的标志性蛋白)观察大脑皮层星形胶质细胞的激活情况；western blot检测GFAP蛋白含量。6.大脑皮层前炎性因子的测定：qRT-PCR检测前炎性因子TNF-a的mRNA含量。7.基准剂量法计算效应标志物的基准剂量(benchmark dose, BMD)和BMD的可信限下限(BMD lower confidence limit, BMDL)。结果1.1-BP染毒大鼠出现认知功能障碍：水迷宫结果显示,与对照组相比,200、400和800 mg/kg bwl-BP组大鼠逃避潜伏期显著增加、目标象限时间百分比显著减少(p<0.05,p<0.01),400和800 mg/kg bwl-BP组大鼠游泳路程显著增加、穿越平台次数显著减少(p<0.05,p<0.01)。2.1-BP造成大鼠PL神经元减少；与对照组相比,100、200、400和800 mg/kg bwl-BP组大鼠PL区域第5层神经元数量呈剂量依赖性降低(p<0.01),第2/3层和第6层无显著变化。3.1-BP引起氧化应激：与对照组相比,100、200、400和800 mg/kg bwl-BP组大鼠大脑皮层GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性显著减少(p<0.01),GSSG含量显著增加(p<0.01)；1-BP染毒大鼠大脑皮层4-HNE和HEL氧化修饰蛋白含量显著增加(p<0.01)；200、400和800 mg/kg bwl-BP组大鼠大脑皮层Ngb含量呈剂量依赖性减少(p<0.01)。4.1-BP导致大脑皮层星形胶质细胞显著激活：免疫荧光GFAP染色显示星形胶质细胞显著激活；与对照组相比,1-BP染毒组大鼠大脑皮层GFAP蛋白含量显著升高(p<0.01)。5.1-BP引起前炎性因子TNF-a表达上调：qRT-PCR结果显示1-BP染毒组大鼠大脑皮层TNF-a的mRNA水平显著增加(p<0.05)。6.大脑皮层GSH/GSSG比值是反映1-BP CNS毒性较敏感的指标。行为学效应指标逃避潜伏期(第4d)、游泳路程(第4d)、目标象限时间百分比和穿越平台次数的1-BP的BMDL分别为49.39、75.90、73.11和97.67 mg/kg.bw/day;生化效应指标大脑皮层GSH含量、GSH/GSSG比值和GCL活性的1-BP的BMDL分别为59.61、23.40和64.85 mg/kg.bw/day。结论1.1-BP能够引起大鼠学习记忆损伤,这可能与1-BP导致记忆功能的重要参与者mPFC的PL第5层神经元数量减少有关。2.1-BP能够造成GSH耗竭、引起脂质过氧化并降低对神经元有保护作用的Ngb的含量。氧化损伤和神经保护物质的减少可能与神经元丢失有关。3.1-BP引起星形胶质细胞激活,前炎性因子TNF-a表达上调。神经元丢失可能与激活的星形胶质细胞释放炎性介质和ROS导致神经元受损和死亡有关。4.大脑皮层GSH/GSSG比值是反映1-BP CNS毒性较敏感的指标。