抗菌肽是一类具有抗菌活性的内源性小分子多肽,广泛存在于生物界,具有广谱杀菌作用,且不会产生耐受性,是机体非特异性免疫的重要组成部分。Hepcidin是一类富含半胱氨酸的抗菌肽,在肝脏中的表达量较高,又称之为肝脏表达的抗菌多肽,在体内或体外具有抑制细菌、真菌及原生动物生长的作用,并且具有调节机体铁代谢的功能。本文根据斑马鱼hepcidin cDNA序列设计引物,克隆得到鲤鱼hepcidin的cDNA片段,然后采用RACE技术得到其全长cDNA,并对其编码的多肽结构和系统进化进行了分析;采用PCR方法扩增得到了鲤鱼hepcidin的基因组DNA序列,并对其内含子-外显子结构进行了分析;采用RT-PCR方法检测了hepcidin mRNA在正常鲤鱼肝脏、脾脏、头肾、前肠、后肠、口腔上皮、鳃、皮肤、肌肉、性腺和血液等组织的分布,采用Real-time PCR技术检测了鳗弧菌浸泡刺激后鲤鱼肝脏、头肾、前肠和后肠中hepcidin mRNA水平的变化;构建了原核表达载体pET32a(+)/hepcidin,并转入大肠杆菌AD494(DE3)中诱导表达,表达的融合蛋白经肠激酶酶切后,采用抑菌圈法检测其对大肠杆菌的抑菌活性。鲤鱼hepcidin cDNA全长647 bp,由46 bp的5’非翻译区(5’-UTR),276 bp的开放阅读框(ORF)和325 bp的3’非翻译区(3’-UTR)组成,其中ORF区编码91个氨基酸的前体hepcidin,由24个氨基酸残基的信号肽、42个氨基酸残基的前域和25个氨基酸残基的成熟肽组成。鲤鱼hepcidin成熟肽由25个氨基酸组成,含有8个保守的半胱氨酸残基,通过4个链内二硫键形成短的发卡结构,拐角处有一特殊的二硫键,可能与多肽的抗菌活性直接相关。鲤鱼hepcidin基因组DNA全长1209 bp,由三个外显子和两个内含子组成,外显子1编码部分5’-UTR、信号肽和部分前域,外显子2编码部分前域,外显子3编码部分前域、成熟肽和3’-UTR。序列比对和系统进化表明,鱼类hepcidin序列之间的相似性较高,而鱼类与哺乳动物和两栖动物处于不同的分支上,在鱼类中,鲤鱼与斑马鱼、鲶鱼处于同一分支,其中,鲤鱼与斑马鱼的亲缘关系最近。RT-PCR检测表明,在正常鲤鱼中,肝脏中hepcidin mRNA水平最高,其次为脾脏、后肠、头肾、前肠、口腔上皮、皮肤、性腺和血细胞,在鳃中的水平较低,而在肌肉中则未检测到其mRNA。Real-time PCR检测表明,鲤鱼经过鳗弧菌浸泡刺激后,各组织hepcidin mRNA水平整体呈现先升高后下降的趋势,但不同组织的变化模式并不相同。肝脏、头肾和后肠hepcidin mRNA水平在刺激后6 h就达到最大值,肝脏中约为正常水平的3倍,头肾和后肠可达到正常水平的17倍;前肠hepcidin mRNA水平在刺激后6 h开始升高,到72 h才达到最大值,约为正常水平的8倍。鲤鱼hepcidin成熟肽cDNA长75 bp,本实验在其两端设计带酶切位点的引物,PCR扩增片段双酶切后与pET-32a(+)质粒连接,构建pET-32a(+)/hepcidin原核表达载体,重组质粒经双酶切和测序鉴定正确后,用于后续的诱导表达。pET-32a(+)/hepcidin重组质粒转化大肠杆菌AD494(DE3),经IPTG诱导融合蛋白的表达,超声裂解细菌,SDS-PAGE检测,细菌裂解上清和包涵体沉淀中在分子量为20 kD处均有一特异性条带,与hepcidin融合蛋白的预期分子量(20.2kD)基本一致。以可溶性形式表达的融合蛋白在诱导后2 h开始出现,以后表达量逐渐升高,到第6 h时达到最大比例,稳定至10 h后又逐渐下降;以包涵体形式表达的融合蛋白也是在诱导后2 h开始出现,以后有所升高,但没有明显的规律,且相应诱导时间的表达量低于可溶性形式表达的融合蛋白。因此,在后续的融合蛋白的大量诱导实验中,采用诱导6 h的可溶性形式的融合蛋白,结果表明,融合蛋白的浓度明显高于小量诱导的蛋白,可以用于下一步的实验。大量诱导表达的hepcidin融合蛋白经肠激酶酶切后,采用抑菌圈法检测表明,其对大肠杆菌具有一定的抑菌活性。因此,原核表达的hepcidin可以用于hepcidin功能的进一步研究。