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第一部分 NDRG1表达上调对宫颈癌细胞Siha增殖与周期的影响
目的:探讨表达质粒转染细胞使人N-myc下游调节基因1(N-myc downstream regulated gene 1, NDRG1)表达上调后对宫颈癌细胞Siha增殖、周期及凋亡的影响。
方法:通过RT-PCR检测宫颈组织标本和宫颈癌细胞中NDRG1的Mrna表达水平,宫颈组织标本包括正常宫颈组织19例,宫颈上皮内瘤样病变(cervicAlintraepitheliAlneoplasia, CIN)18例,宫颈癌组织63例;宫颈癌细胞包括Siha、Hela。构建真核表达质粒Pegfp-N1-NDRG1,由脂质体介导将表达质粒稳定转染到宫颈癌细胞株Siha中,用RT-PCR和Western blot鉴定NDRG1的表达,MTT法描绘细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期的改变。
结果:正常宫颈组织和CIN的NDRG1Mrna表达水平明显高于宫颈癌组织和细胞(P<0.001)。重组质粒Pegfp-N1-NDRG1转染Siha细胞后,NDRG1Mrna表达增加了(1.73±0.23)倍,蛋白表达水平增加了(1.27±0.82)倍(P<0.001)。NDRG1表达上调后细胞生长速度减慢(P<0.001),细胞在G1期发生细胞周期阻滞和S期细胞减少(P<0.05),细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)。
结论:真核表达质粒Pegfp-N1-NDRG1能特异性增加NDRG1基因表达,NDRG1表达上调后能抑制宫颈癌细胞的生长,发生细胞周期阻滞,但是对细胞凋亡无明显影响。
第二部分 NDRG1表达上调对体外宫颈癌细胞Siha侵袭转移的影响
目的:探讨人类N-myc下游调节基因1(N-myc downstream regulated gene 1, NDRG1)表达上调后对宫颈癌细胞Siha侵袭转移、血管生成和细胞粘附力的影响。
方法:真核表达质粒Pegfp-N1-NDRG1由脂质体介导稳定转染到宫颈癌细胞株Siha使NDRG1基因表达上调,Transwell体外侵袭实验和迁移实验检测细胞的侵袭和迁移能力。Western blot法检测血管生成因子VEGF和细胞粘附分子E-cadherin的蛋白表达变化。
结果:重组表达质粒Pegfp-N1-NDRG1转染Siha细胞后,体外侵袭实验和迁移实验显示细胞侵袭力下降(31.71±0.11)%,迁移能力下降(30.43±0.05)%(P<0.05),在蛋白水平上VEGF明显下降和E-cadherin明显增高(P<0.001)。
结论:NDRG1表达上调后能抑制宫颈癌细胞的侵袭和转移能力,使血管生成因子和细胞粘附分子的蛋白表达明显下降或增高,提示NDRG1可能在宫颈癌侵袭转移中起重要作用。为宫颈癌的靶向治疗提供实验依据。
第三部分 NDRG1与Egr1在信号转导通路中表达调控机制的实验研究
目的:探讨人宫颈癌细胞中N-myc下游调节基因1(N-myc downstream regulated gene 1, NDRG1)与早期生长反应基因1(early growth response gene 1, Egr1)在信号转导通路中表达调控的关系。
方法:以人宫颈癌细胞株Siha为研究对象,利用siRNA干扰技术对Egr1基因进行沉默,RT-PCR和Western blot检测Egr1基因沉默效果。通过Western blot检测细胞在低氧条件下Egr1与NDRG1的蛋白表达变化,以及RT-PCR检测细胞转染siRNA-Egr1后在低氧与低氧模拟物(如铁螯合剂deferoxamine, DFX)条件下,Egr1与NDRG1的表达变化。
结果:siRNA-Egr1能有效抑制Egr1基因表达(P<0.001)。在低氧条件下,Egr1和NDRG1的蛋白水平均明显升高(P<0.001)。转染siRNA-Egr124h后,细胞重新在低氧条件下作用,结果Egr1Mrna表达显著下降(P<0.05)。转染siRNA-Egr124h后,细胞在低氧及低氧模拟物(如铁螯合剂deferoxamine, DFX)条件下作用24h,结果显示与低氧条件比较DFX能够使NDRG1Mrna表达显著升高(P<0.05)。同时沉默Egr1基因后能够使NDRG1Mrna水平明显减少(P<0.05)。
结论:体内环境因素如低氧、低氧模拟物(deferoxamine, DFX)等上调NDRG1基因的表达,通过Egr1调节途径参与了其在宫颈癌细胞中的表达。