子宫内膜异位症（EMS,endometriosis）,简称内异症,是一种以雌激素依赖性、慢性炎症和不孕及腹痛等多种症状为特征的疾病,组织学表现为子宫内膜组织出现在子宫以外的部位,影响约10%的育龄期妇女。子宫内膜异位症的确切诊断主要依靠手术切除异位灶后的病理学检查,而其发病机制目前涉及学说较多,尚无一个单独学说可以解释各种类型的内异症。在目前已提出的子宫内膜异位症发病机制中,免疫和炎症学说被广泛接受。中性粒细胞和巨噬细胞的激活导致促炎细胞因子如白细胞介素（IL）-6释放和子宫内膜异位灶血管生成,从而使得异位灶生长和存活。参与子宫内膜异位症促炎环境形成的的大多数蛋白质通过核因子-kappa B（NF-κB）增加,并已被证明通过Toll样受体-髓样分化因子88（TLR-My D88）信号通路促进子宫内膜异位症细胞增殖。在此过程中,来自细菌的脂多糖（LPS）等与子宫内膜异位细胞上的受体（TLR）结合,并通过IκB（NF-κB抑制蛋白）的磷酸化和泛素化激活经典的NF-κB信号通路,从而使p65/p50二聚体（之前被IκB灭活）被磷酸化为p-p65/p50（活化）并随后与DNA结合。这可能会引发一系列靶基因上调,例如IL-6、IL-1β和巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）。近年来高通量测序技术的发展和微生物组学研究越来越受到人们的关注,肠道菌群对子宫内膜异位症患者的影响研究报道颇多,但阴道菌群对子宫内膜异位症患者的影响研究较少。阴道作为一个拥有超过300种细菌定植的腔道——2020年2月Nat Commun.杂志,其中多种细菌与妇科疾病密切相关,如细菌性阴道病（BV）、性传播疾病（STD）。已有研究表明,通过恢复正常的阴道菌群,这些疾病的进展可能会得到缓解。基于以往许多疾病的发生与微生物失衡密切相关的文献报道,推测子宫内膜异位症的发生也可能与阴道菌群紊乱有关。为此,本研究首先利用高通量测序技术,分析健康育龄期妇女与子宫内膜异位症患者阴道菌群的多样性差异及与子宫内膜异位症发生发展的关系;然后构建子宫内膜异位症小鼠模型,在动物水平上进行干预性研究,运用分子生物学技术,从NF-κB信号通路调控进一步探讨阴道菌群对内异症发生发展及机制的影响,为进一步揭示内异症发生发展机制、为拓宽内异症的治疗思路提供新的思考。第一部分阴道菌群多样性变化与子宫内膜异位症发生发展的关系研究目的:分析子宫内膜异位症患者、健康育龄期妇女阴道菌群的多样性差异及与子宫内膜异位症发生发展的关系。方法:1、伦理委员会批准后（中国临床试验注册中心注册号Chi CTR2000039078）,随机选择2020年9月至2021年3月在南昌大学第二附属医院就诊的16例内异症患者为子宫内膜异位症组（均为术后病理学确诊卵巢子宫内膜异位囊肿）、18例无已知相关疾病的健康育龄期妇女为健康育龄期妇女组,在取得知情同意后被纳入该研究。子宫内膜异位症组及健康育龄期妇女组分别采取统一的纳入、排除标准。记录研究对象的基本临床信息（年龄、BMI、流产次数等）和血液检验结果（AMH,CA125,代表炎症的NLR等）。子宫内膜异位症组纳入标准:1.年龄18-50岁;2.根据症状、体征、辅助检查临床诊断为子宫内膜异位症;3.3天内无性生活、无阴道冲洗及阴道上药等,7天内无宫颈治疗,30天内未使用抗生素类药物;4.阴道分泌物检查无异常,血常规化验白细胞计数及中性粒细胞比在正常范围内。健康育龄期妇女组纳入标准:1.年龄18-50岁;月经周期规律（28±7天）;2.健康体检人群;3.3天内无性生活、无阴道冲洗及阴道上药等,7天内无宫颈治疗,30天内未使用抗生素类药物;4.阴道分泌物检查无异常,血常规化验白细胞计数及中性粒细胞比在正常范围内。2、取样:阴道分泌物标本的取样方法如下:门诊就诊或住院患者治疗前,取截石位,无菌扩阴器支撑阴道壁,用一次性无菌拭子在阴道取样。采集后立即（运输时间不超过30min）放入-80摄氏度冰箱冻存。血液于同一时间（治疗前）采集。异位灶病理标本待治疗性手术切除后常规记录。3、高通量测序及分析:16例子宫内膜异位症患者和18例健康育龄期妇女,每个个体采集1份阴道分泌物标本进行阴道菌群高通量测序分析。并根据测序结果分析与临床指标的相关性。结果:1、根据r-ASRM（美国生殖医学学会修订版）评分,子宫内膜异位症组有9名患者为3-4期,7名患者为1-2期。2、两组一般临床指标的比较:子宫内膜异位症组与健康育龄期妇女组之间的年龄、体重指数没有显著差异（p＞0.05）;子宫内膜异位症组的流产次数是0.88±0.96,健康育龄期妇女组流产次数是0.11±0.32,子宫内膜异位症组的流产次数大于健康育龄期妇女组（p＜0.05）;子宫内膜异位症组的AMH是1.13±1,健康育龄期妇女组AMH是4.07±1.09,子宫内膜异位症组的AMH低于健康育龄期妇女组（p＜0.05）;子宫内膜异位症组的CA125是67.33±28.63,健康育龄期妇女组的CA125是14.43±4.49,子宫内膜异位症组的CA125高于健康育龄期妇女组（p＜0.05）;子宫内膜异位症组的NLR是2.26±0.8,健康育龄期妇女组的NLR是1.82±0.38,子宫内膜异位症组的NLR高于健康育龄期妇女组（p＜0.05）。3、两组阴道菌群多样性比较:（1）两组α多样性的Shannon指数（估计总物种）和Chao1指数（群落多样性）无显著差异（p＞0.05）。根据距离矩阵与PCo A分析,子宫内膜异位症组的阴道微生物β多样性与健康育龄期妇女组相比存在差异（21.8%vs 12.6%,未加权Uni Frac距离法）。两组阴道细菌群落由隶属于28门的154属组成。（2）在门和属水平上,子宫内膜异位症组的阴道菌群组成与健康育龄期妇女组不同:优势属的相对丰度比较表明,放线菌门（尤其是有害的加德纳菌和阿托波菌）在子宫内膜异位症患者显著富集（从0.23%到21.59%）,而厚壁菌门（尤其有益的是乳杆菌）在子宫内膜异位症患者中下降（从98.25%到68.79%）。为了进一步确定子宫内膜异位症组和对照组之间哪些细菌分类群是不同的,本研究进行了LDA效应大小（LEf Se）分析（LDA 3.5）,并确定了具有显著差异的属:包括Alloscardovia和Cloacibacterium及Gardnerella等。4、阴道菌群高通量测序与临床指标相关性分析表明:阴道乳杆菌的相对丰度与血液中性粒细胞呈现负相关（r=-0.5039,p＜0.05）;Megasphaera,Shuttleworthia相对丰度上升与血液CA125（r=0.5455,p＜0.05）及NLR正相关（r=0.6035,p＜0.05）。结论:1、与健康育龄期妇女组阴道菌群相比,子宫内膜异位症患者组阴道菌群的α多样性无明显差异,β多样性存在差异。2、子宫内膜异位症患者阴道菌群存在有益菌（乳杆菌等）相对丰度的下降,有害菌（加德纳菌等）相对丰度的增加;阴道菌群中乳杆菌相对丰度下降与血液中性粒细胞水平正相关;Megasphaera,Shuttleworthia上升与血液CA125及NLR正相关。第二部分阴道菌群对小鼠子宫内膜异位症进展影响的机制研究目的:研究阴道菌群对小鼠子宫内膜异位症进展影响的机制。方法:1、腹腔注射子宫内膜段法建立小鼠内异症模型:供体小鼠腹腔注射雌激素1-2个性周期,2%异氟烷麻醉并脱颈椎处死后分离子宫;子宫内膜剪碎为直径约1mm碎片并按1:2比例腹腔注射于受体小鼠;3周后超声确认异位灶在受体小鼠腹盆腔定植及生长。2、实验分组:分为健康对照组（C组）、内异症模型组（M组,小鼠阴道仅使用可吸收明胶海绵水,每3天1次,共3周）;混合抗生素组（ABX组,含有0.5克/升万古霉素、1克/升新霉素、1克/升甲硝唑和1克/升氨苄青霉素的溶液,将浸泡在混合抗生素中的可吸收明胶海绵放置在模型小鼠阴道,每3天1次,共3周）;小白菊内酯组（parthenolide,一种NF-κB信号通路阻断剂,模型小鼠腹腔注射10mg/kg,每周4次,共3周）。3、组织学检查:高分辨率小动物超声每周1次观察腹盆腔异位灶变化。治疗3周后2%异氟烷麻醉并脱颈椎处死小鼠,解剖观察病灶变化。HE染色、免疫组化（Ki-67和Iba-1）对子宫内膜和异位灶进行组织学检查。4、分子生物学检测:q-PCR检测小鼠腹腔液炎性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平变化。WB检测小鼠异位内膜NF-κB通路关键蛋白（TLR4,My D88,p65,p-p65）变化,结果:1、小鼠内异症建模后干预3周,与模型组小鼠相比（异位灶23.74±3.70mm）,使用ABX（异位灶20.33±3.45mm）和小白菊内酯（异位灶16.63±2.00mm）的小鼠的子宫内膜异位病变较小（p＜0.05）,与ABX组相比,小白菊内酯组的子宫内膜异位病变更小（p＜0.05）。2、HE染色,模型组小鼠的异位灶具有典型的子宫内膜异位样结构,包括厚的上皮层和较多的腺体区域,而ABX（混合抗生素VNMA处理）组小鼠和小白菊内酯组小鼠的异位病变具有较薄的上皮区域和较少的腺体;与模型组小鼠相比,ABX小鼠和小白菊内酯小鼠的病变基质面积更小。ABX小鼠和小白菊内酯小鼠（尤其是小白菊内酯小鼠）的异位灶与模型组相比,增殖标记物Ki-67阳性的上皮细胞、巨噬细胞标志物Iba-1减少。3、异位灶NF-κB通路相关蛋白及腹腔液炎性因子水平:相比于模型组的异位灶,ABX组NF-κB通路相关蛋白的表达下降,而小白菊内酯也抑制p65/p-p65。类似地,与模型组小鼠相比,ABX小鼠和小白菊内酯小鼠腹腔液中的IL-1β、TNF-α和IL-6浓度降低。结论:给予内异症模型小鼠腹腔注射小白菊内酯、阴道使用混合抗生素（VNMA）后,NF-κB通路相关蛋白的表达下降,小鼠腹腔液中炎性因子水平下降,异位灶组织学增殖水平下降、体积减小。全文总结:与健康育龄期妇女组阴道菌群相比,子宫内膜异位症患者组阴道菌群的多样性存在改变（β多样性存在差异）。阴道菌群存在有益菌（乳杆菌等）相对丰度的下降,有害菌（加德纳菌等）相对丰度的增加。小鼠阴道使用混合抗生素溶液VNMA,可以通过阻断NF-κB通路抑制内异症病灶进展,但这种抑制效果弱于小白菊内酯。