芬苯达唑(fenbendazole)是苯并咪唑类驱虫药,具有抗虫谱广,效果好,价格低,毒性低等特点,被广泛应用于畜牧行业。近年研究发现芬苯达唑具有较好的抗肿瘤活性,但其抗肿瘤机制还没有完全明晰。乳腺肿瘤是人类以及犬猫的高发肿瘤之一,全球女性中乳腺肿瘤发病率占所有癌症发病率的近四分之一,2012年全球共有乳腺肿瘤病案168万,因乳腺癌死亡人数52万。随着国内宠物临床诊断技术的不断提高,在宠物临床方面,犬、猫等宠物的乳腺肿瘤发病率也在逐年升高,为畜主带来巨大的心理压力和经济压力。本试验在前人研究基础上,利用网络药理学相关技术手段寻找芬苯达唑的潜在作用靶点进而研究芬苯达唑抗乳腺肿瘤作用机制。并且在试验过程中发现芬苯达唑可介导p53、p53R2以及Pirh-2抑制乳腺肿瘤的增殖,还可诱导肿瘤细胞发生焦亡反应,进而发挥其抗肿瘤作用。为兽医和人医临床乳腺肿瘤治疗提供参考。方法:1.使用Pub Chem数据库获取芬苯达唑的2D、3D结构图,登陆Pharm Mapper数据库进行靶点预测。登陆Gene Card数据库、NCBI数据库搜索与乳腺肿瘤相关的靶点,对搜索结果进行整理,剔除重复靶点基因后保存,得到乳腺肿瘤相关靶点;并用芬苯达唑的潜在作用靶点绘制韦恩图,获得芬苯达唑对乳腺肿瘤的潜在关键治疗靶点。使用STRING数据库将芬苯达唑对乳腺肿瘤的潜在关键治疗靶点构建靶蛋白互作网络。对靶蛋白进行生物功能注释分析。2.CCK-8法检测芬苯达唑对小鼠乳腺肿瘤细胞系EMT6体外细胞毒性。3.使用倒置三目显微镜拍摄芬苯达唑作用EMT6细胞24h后,细胞形态的变化。4.使用乳酸脱氢酶检验试剂盒检测芬苯达唑给药24h后,乳酸脱氢酶的释放率。5.流式细胞术检测芬苯达唑给药24h后EMT6细胞焦亡率。6.使用实时荧光定量PCR验证芬苯达唑对乳腺肿瘤作用关键靶点的m RNA水平。并检测焦亡通路相关基因的m RNA水平。结果:1.经过网络药理学预测分析,芬苯达唑治疗乳腺肿瘤的关键靶点主要集中在P53信号通路,其中P53基因及其下游靶基因P53R2对乳腺肿瘤的发生发展有重要作用。2.经CCK-8检测,芬苯达唑对小鼠乳腺肿瘤细胞EMT6的抑制作用呈浓度依赖和时间依赖关系,其中2μM作用24h抑制率约为40%。3.EMT6细胞经芬苯达唑处理24h后,细胞形态发生显著变化,部分细胞可见细胞胀大,质膜出现大气泡,细胞膜不完整。4.乳酸脱氢酶检测结果显示,芬苯达唑作用EMT6细胞24h后,给药组的乳酸脱氢酶释放量高于空白对照组,提示给药组细胞膜破溃,细胞质内的乳酸脱氢酶释放到细胞外。5.经流式细胞术检测芬苯达唑给药24h后EMT6细胞焦亡数量升高,显著高于对照组。6.实时荧光定量PCR结果证明网络药理学的预测结果,其中关键基因p53、p53R2、Pirh-2的相对m RNA水平显著升高,提示芬苯达唑通过作用于p53、p53R2、Pirh-2三个靶基因抑制乳腺肿瘤的生长。7.细胞焦亡相关因子的相对m RNA水平检测结果显示:与对照组相比,IL-1β、IL-18、GSDMD、GSDME的相对m RNA水平极显著上升。caspase-3的相对m RNA水平显著提高。NLRP3的相对m RNA水平极显著下降。结论:芬苯达唑可通过调控p53、p53R2以及抑制乳腺肿瘤生长,也可通过诱导GSDMD、GSDME介导细胞焦亡通路抑制乳腺肿瘤细胞增殖。