没食子酸酯基多酚对淀粉消化酶的抑制作用

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淀粉类食物是我国居民日常生活的主食,其消化速率决定餐后血糖水平高低,对维持人体糖代谢吸收很重要。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是淀粉消化过程中的关键酶,催化淀粉水解生成葡萄糖,抑制消化酶的活性是调控血糖的重要方法之一。植物中的多酚物质来源广泛,结构种类多,已被证明通过非共价作用抑制酶活性,降低底物消化率,其结构中的功能基团决定了对酶的抑制效果。没食子酸酯基(Galloyl moiety,GM)是多酚的一种重要结构基团,前期研究发现GM可以提升多酚的生理活性,但多酚中不同GM结构特征与对应的酶抑制效果尚不明确。因此,基于GM对多酚结构组成及酶抑制效果的重要性,进一步探究了以GM为特征基团的多酚与α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶之间的相互作用,从多酚结构水平分析酶抑制结果,有助于更清晰的认识分子结构与抑制作用之间的构效关系,为多酚与淀粉消化酶相互作用解析提供新的理论依据,指导富含该类型多酚的植物性食物的开发利用。本文主要的研究内容如下:(1)选取以GM为特征取代基的9种没食子酸酯基多酚(GM多酚),没食子酸、金缕梅单宁、鞣花酸、1,3,6-O-三没食子酰基葡萄糖、柯里拉京、石榴皮鞣素、1,2,3,4,6-O-五没食子酰基葡萄糖、安石榴苷、单宁酸,包括不同GM数量和不同GM连接方式,其中与糖环只有酯键连接的GM定义为自由GM,而除了与糖环之间的酯键外还有额外分子内化学键连接的GM定义为非自由GM。9种多酚对猪胰腺α-淀粉酶(PPA)的抑制结果表明,带自由GM多酚比非自由GM多酚表现出显著的抑制作用;且带自由GM多酚对PPA呈竞争性抑制,即与淀粉竞争PPA的活性位点,抑制能力随自由GM的数量增加而增强。所有表征多酚与PPA结合力的常数,包括竞争性抑制常数的倒数(1/Kic),荧光淬灭系数(KFQ)和结合能(Eb),都随自由GM数的增加而增大;此外,多酚1/Kic,KFQ和Eb的顺序与IC50的顺序相反,表明多酚-PPA的相互结合导致酶抑制;二者的相互结合是由PPA活性位点的特征氨基酸残基和自由GM之间形成的氢键和π-π共轭力驱动的,且主要以静态机制淬灭PPA的荧光强度;非自由GM多酚由于分子中额外的化学键有更刚性的平面结构,因此无法以合适的姿态与PPA互作,多酚的酶抑制效果减弱。在小鼠血糖测试中,两种带5个自由GM多酚有降血糖效果,证明自由GM作为功能基团可抑制酶活性,降低淀粉消化率。(2)继续研究了9种多酚对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,对于带自由GM多酚,其抑制能力随自由GM数量的增加大大增强;带非自由GM多酚对酶的抑制能力取决于其分子结构,GM之间的分子内化学键会削弱多酚的抑制能力,但鞣花酸和六羟基联苯酚基(HHDP)有助于多酚对酶的抑制;自由GM不仅可以与α-葡萄糖苷酶的活性位点结合(竞争性抑制),而且还可以与非活性位点结合(非竞争性抑制),但是,前者的结合作用要强于后者;非自由GM之间的连接会使多酚分子结构更复杂而结合在酶非活性位点,呈非竞争性抑制;所有具有抑制作用的多酚都通过形成多酚-酶复合物,以静态机制淬灭α-葡萄糖苷酶的荧光强度;随着抑制能力的增强,参与多酚-α-葡萄糖苷酶相互作用的特征氨基酸残基数也增加,氢键和π-π共轭力(平行和垂直)是主要驱动力。综上,GM的数量及分子内化学键引起的结构灵活性,对没食子酸酯基多酚发挥酶抑制效果有至关重要的影响,作为特征取代基,GM通过非共价作用力与酶活性/非活性位点的氨基酸残基互作,淬灭酶荧光强度,阻碍了底物和酶的正常结合,从而降低底物消化率。本研究丰富了GM多酚对酶抑制作用的构效关系,GM可作为特征基团筛选天然物质中潜在的酶抑制剂,或可用于调控淀粉消化的功能因子的开发。
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