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志贺菌是具有高度传染性和严重危害性的肠道致病菌,主要侵袭肠粘膜上皮细胞,引起腹痛、腹泻和排黏液性脓血便,严重者可导致死亡。相关资料表明,志贺菌的宿主具有广泛性,不但感染人引起痢疾,还可引起犊牛、犬、仔猪、鸡、小鼠、兔、猴、豚鼠等多种动物感染,其中幼龄动物患病率和死亡率高。目前,志贺菌对人的侵袭感染机制已研究的比较深入,当志贺菌接触到宿主细胞时,毒力大质粒上的Ⅲ型分泌系统（T3SS）分泌到菌体外的侵袭性蛋白IpaB、IpaC可形成复合物,复合物的IpaC端首先与肠上皮细胞基底面的受体结合,进一步介导细菌侵入细胞。关于动物感染志贺菌的病例已多次报道,但致病机制方面缺乏进一步的研究。自2004年志贺菌被发现可以感染鸡后,对鸡源志贺菌的相关研究表明了其IpaC蛋白与人源株同源性很高,但是鸡肠上皮细胞上是否具有相应的IpaC蛋白受体尚不清楚。本研究运用GST pull-down技术,筛选鸡源志贺菌IpaC蛋白在鸡肠上皮细胞膜的受体,为阐明鸡源志贺菌的感染机制提供了科学依据,对有效防控该病具有重要意义。研究结果如下:1.鸡源志贺菌IpaC基因原核表达载体的构建与表达本试验以质粒pET32a-IpaC为模板,根据原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点和IpaC基因序列设计引物,成功克隆了鸡志贺菌IpaC基因,然后将IpaC基因与载体pGEX-4T-1构建重组表达载体并转化至E.coli BL21（DE3）中,同时转化空载体作为对照。用诱导剂IPTG诱导表达转化成功的菌株pGEX-4T-1-IpaC/BL21和pGEX-4T-1/BL21,SDS-PAGE结果表明成功表达了目的蛋白。优化诱导温度、诱导时间及诱导剂IPTG的浓度,确定当菌液培养至OD600为0.8时,加入终浓度0.5 mmol/L的IPTG,28℃诱导8 h为最佳诱导条件。将诱导的全菌体冰上超声破碎,破碎上清经GST琼脂糖纯化后得到了GST-IpaC融合蛋白及GST蛋白,蛋白纯化效果较好,可达90%以上。利用IpaC鼠单抗及HRP标记的抗GST标签鼠单抗进行Western blot鉴定,结果表明表达的蛋白具有IpaC蛋白活性及GST蛋白活性。2.鸡肠上皮细胞的培养及膜蛋白的提取本试验选用18日龄的SPF鸡胚,采用300 U/mL的XI型胶原酶及0.1 mg/mL的I型中性蛋白酶联合消化鸡胚肠组织,并利用贴壁时间差法来纯化肠上皮细胞。通过形态观察及碱性磷酸酶染色法对培养的肠上皮细胞进行鉴定,在倒置显微镜下可看到鸡肠上皮细胞呈铺路石样紧密排列,碱性磷酸酶染色呈阳性。用ProteoExtract?跨膜蛋白提取试剂盒提取鸡肠上皮细胞膜蛋白,通过SDS-PAGE电泳观察提取的肠上皮细胞膜蛋白,并用Na+/K+-ATPaseα1兔源多克隆抗体对膜蛋白中的Na+-K+-ATP酶进行Western blot鉴定,证明膜蛋白被成功提取。3.GST pull-down技术筛选鸡源志贺菌IpaC蛋白的鸡肠上皮细胞膜受体本试验利用原核表达的GST-IpaC融合蛋白及GST蛋白,通过GST pull-down技术,筛选鸡肠上皮细胞膜蛋白中的IpaC受体分子,GST pull-down产物经SDS-PAGE及Western blot检测后,将目的条带通过液相色谱-电喷雾电离串联质谱（LC-ESI-MS/MS）进行检测,对检索到的肽段进行同源蛋白的聚类分析,结合IpaC蛋白相关功能,得到5种IpaC蛋白的候选受体,分别为:Annexin A2、Epithelial cell adhesion molecule、Rab23 GTPase、Actin-related protein 2、PDZ and LIM domain protein 7,并根据其蛋白登录号明确了氨基酸序列。关于确切的IpaC受体及该受体的蛋白结构和相关的生物学功能有待进一步研究。