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本研究通过对日本乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)和日本乙型脑炎病毒贵州分离强毒株(GZ株)细胞培养物总RNA的提取,RT-PCR方法分别扩增出NS1、NS2A和NS1-NS2A基因,并对其进行克隆和真核表达质粒的构建,通过生物信息学分析、真核表达质粒的表达以及动物实验研究日本乙型脑炎强弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-NS2A真核表达的差异。1.乙型脑炎强弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A基因的克隆参照GenBank已公布的SA14-14-2株(AF315119),SA14(U14163)和GZ株(KC915016)基因组序列,应用Primer5.0软件设计并合成6对特异性引物,以日本乙型脑炎减毒活疫苗(SA14-14-2株)和日本乙型脑炎病毒贵州分离强毒株(GZ株)细胞培养物总RNA为模板分别扩增NS1、NS2A和NS1-2A全基因并观察JEV强弱毒株细胞病变效应(CPE)差异;将目的基因克隆至pMD19-T Simple载体,并转化至Top10感受态细胞中,通过菌落PCR鉴定阳性菌落后抽提质粒,经双酶切鉴定和测序鉴定,命名为pMD19-T Simple-NS1r、pMD19-T Simple-NS1q、pMD19-T Simple-NS2Ar、pMD19-T Simple-NS2Aq、pMD19-T Simple-NS1-2Ar和pMD19-T Simple-NS1-2Aq(r表示JEV弱毒株SA14-14-2株,q表示JEV GZ株强毒株),结果表明:乙型脑炎病毒强毒和弱毒感染BHK21细胞后的细胞病变效应(CPE)区别十分明显,强毒株感染细胞后产生明显的CPE现象的时间要早于弱毒株,且CPE现象也有典型的差异,其强毒株产生的蚀斑可达2-3mm,弱毒株产生的蚀斑较小仅0.5-1mm;乙型脑炎病毒强弱毒株克隆质粒构建成功。2.乙型脑炎强弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A基因真核表达质粒的构建和生物信息学分析在克隆质粒的基础上,分别将不同克隆质粒双酶切后回收纯化,得到含有BamHI和XhoI酶切位点的不同目的基因片段,将含有酶切位点粘性末端的目的基因分别与经同样双酶切纯化回收的真核表达载体pcDNA3.1(+)在T4连接酶的作用下连接,并将连接产物转化至Top10感受态细胞中,通过菌落PCR鉴定阳性菌落后抽提质粒,经双酶切和测序鉴定,分别命名为pcDNA3.1(+)-NS1r、pcDNA3.1(+)-NS1q、pcDNA3.1(+)-NS2Ar、pcDNA3.1(+)-NS2Aq、pcDNA3.1(+)-NS1-2Ar和pcDNA3.1(+)-NS1-2Aq。通过MegAlign软件分析目的基因片段的序列和氨基酸差异,应用软件ExPASY(Protparam)程序和EditSeq对目的蛋白氨基酸序列进行理化性质的分析,同时用ProtScale程序分析蛋白疏水性,应用DNAstar软件中的Protan程序对目的蛋白的二级结构进行预测,进一步应用SIB生物信息学资源门户ExPASy中的在线跨膜区预测,最后应用TMpred程序对蛋白跨膜情况分析。结果表明:乙型脑炎病毒强弱毒株真核表达质粒构建成功,并通过相关软件初步分析发现强弱毒株NS1、NS2A和NS1-2A蛋白都没有信号肽,属于胞内表达蛋白,其氨基酸的改变没有影响其信号肽的有无,但弱毒株的NS2A蛋白与强毒株相比在99-121位多形成一个跨膜区,对于其它蛋白结构域的改变几乎没有影响。3.乙型脑炎强弱毒株非结构蛋白NS1、NS2A和NS1-2A基因真核表达及其差异的研究利用脂质体转染法将构建的真核表达质粒分别转染至BHK-21细胞中进行表达,通过间接免疫荧光技术、RT-PCR检测mRNA以及Western-Blotting试验鉴定质粒表达效果。检测发现转染后24h即可通过RT-PCR检测到目的基因的mRNA,转染后36h可检测到特异性荧光,转染24h后Western-Blotting可分别检测约46.8kDa、17kDa和64.4kDa的特异性反应条带。结果表明:构建的6个真核表达质粒在BHK-21细胞中都能表达,具有一定的反应原性。选取90只4-5周龄Balb/c小白鼠,随机分成9组,每组10只,分为6个实验组和3个对照组(生理盐水组,JEV疫苗组和空载体组),注射按照制定的免疫方法和免疫程序进行免疫。每次免疫间隔2周,在一免前、二免前、三免前及三免后2周,分离血清,利用乙型脑炎ELISA抗体检测试剂盒检测实验动物体液免疫水平。采集三免后三周动物抗凝血利用流式细胞术测定其CD4+和CD8+T细胞含量,检测动物细胞免疫水平。结果表明:构建的重组真核表达质粒免疫小鼠不能够诱导机体产生较高水平的体液免疫。构建的重组真核表达质粒免疫小鼠可以极显著或显著增加CD4+细胞的含量;同时CD8+细胞含量也有所增加。说明构建的真核表达质粒诱发了机体的细胞免疫。强弱毒株非结构蛋白重组真核质粒同组间比较对细胞免疫CD4+的影响为:强弱毒株NS1免疫组和NS1-2A免疫组均是强毒非结构蛋白免疫组略高于弱毒非结构蛋白免疫组,其中强弱毒株NS1免疫组差异显著(P<0.05)。强弱毒株NS2A免疫组弱毒株免疫组增加CD4+细胞的含量略高于强毒株免疫组。强弱毒株非结构蛋白重组真核质粒同组间比较对细胞免疫CD8+的影响为:强弱毒株NS1免疫组、NS2A免疫组和强弱毒株NS1-2A免疫组,均是强毒非结构蛋白免疫组略高于弱毒非结构蛋白免疫组。综合分析数据显示,构建的重组真核表达质粒免疫小鼠可以增强小鼠细胞免疫,显著或极显著的增加CD4+细胞含量,能够增加CD8+细胞含量,强毒组重组真核质粒在小鼠机体表达产生的细胞免疫效果优于弱毒组。