第一部分唯支持细胞综合征致病基因突变的筛查【目的】目前大部分SCOS患者的病因未知,但极有可能还是遗传因素;明确SCOS的病因是发展和完善其诊断体系的重要方面。本研究利用全外显子测序（Whole exome sequencing,WES）,对病因未知的唯支持细胞综合征（Sertoli cell-only syndrome,SCOS）患者的致病基因突变进行筛查。【方法】对一例父母为近亲结婚的男性不育患者进行严格检查和睾丸活检,对其不育进行分类诊断。采集患者的外周静脉血,提取基因组DNA,建库后进行WES;分析WES数据,初步筛选出MAF≤5%、可能改变蛋白结构的、有有害影响的纯合突变,在这些突变中进一步筛选出与精子发生和男性不育相关、睾丸中表达的基因作为可能的致病基因。采集患者直系亲属外周静脉血,提取基因组DNA,对致病基因的突变位点进行Sanger测序,根据测序结果确定致病基因突变的遗传方式。通过免疫组化检测致病基因在患者和可育男性睾丸中的表达。在课题组已有的757例非梗阻性无精子症（Non-obstructive azoospermia,NOA）和709例可育男性外显子测序数据中对致病基因的突变情况进行初步分析。【结果】男性不育患者的染色体核型正常,未检测到Y染色体微缺失,精液常规3次结果显示未见精子,精浆游离DDX4 mRNA为阴性提示睾丸中无生精细胞,睾丸活检未在所观察到的曲细精管中发现生精细胞,只有支持细胞,患者诊断为NOA的SCOS病理类型且为完全的SCOS。对患者WES数据进行分析,初步筛选出10个符合条件的纯合突变,进一步筛选出PIWIL2的移码突变c.731＿732del AT,经预测会使PIWIL2的翻译提前终止,翻译出的PIWIL2蛋白不包含主要结构域,该突变是功能缺失突变。用特异的抗体经免疫组化对患者睾丸组织切片的PIWIL2蛋白表达进行检测,未见阳性信号,而可育男性睾丸中精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞有PIWIL2蛋白表达。Sanger测序结果显示患者父亲和弟弟均携带PIWIL2同一位点的杂合突变,提示PIWIL2功能缺失突变在该家系中为常染色体隐性遗传。对课题组已有的NOA和可育男性外显子数据进行分析后发现,有一位患者携带PIWIL2的g.22145115C>T突变,为纯合错义突变,该突变经Poly Phen-2预测为“很可能有害”,但该患者未做睾丸病理检查,染色体核型分析和Y染色体微缺失结果未见异常。【结论】PIWIL2基因的c.731＿732del AT突变会造成PIWIL2翻译的提前终止以至PIWIL2蛋白功能缺失。结合PIWIL2在精子发生中的重要作用、突变在患者家系中为隐性遗传和患者睾丸中不表达完整的、有功能性的PIWIL2蛋白,PIWIL2的功能缺失突变可能为SCOS的致病基因突变。本研究为首次在SCOS患者中报告PIWIL2的功能缺失突变。第二部分唯支持细胞综合征患者诱导多能干细胞的建立和鉴定【目的】第一部分发现SCOS患者携带PIWIL2功能缺失突变。PIWIL2在人和小鼠生殖细胞中的表达模式和定位不同,其作用可能也不同,只根据PIWIL2（Mili）敲除小鼠模型不能明确PIWIL2功能缺失突变在SCOS中的作用。建立SCOS患者诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell,iPSC）,并对其多能性进行鉴定,用于后续iPSC体外向生殖细胞诱导分化,在此模型中直接验证PIWIL2功能缺失突变对人生殖细胞的影响。【方法】经患者知情同意后,在睾丸显微取精术中取切口处皮肤,用于分离皮肤成纤维细胞。分离的成纤维细胞稳定传代培养后,取第3代细胞用于重编程,用含有OCT4,SOX2,KLF4和C-MYC的慢病毒感染成纤维细胞,使其重编程为iPSC。通过碱性磷酸酶染色、RT-PCR和免疫荧光检测多能性基因的表达、体外拟胚体形成实验对第10代iPSC多能性进行鉴定。对第10代iPSC进行染色体核型分析,用Sanger测序确定PIWIL2基因的突变。【结果】从患者皮肤分离出成纤维细胞,并成功将成纤维细胞重编程为iPSC。构建的iPSC在形态上与人胚胎干细胞（Human embryonic stem cell,hESC）相似,呈碱性磷酸酶阳性,RT-PCR和免疫荧光显示第10代iPSC表达多能性基因OCT4,SOX2,NANOG和TRA 1-60。第10代iPSC在体外可形成拟胚体,免疫荧光检测到分化的细胞表达内胚层基因SOX17、中胚层基因SMA和外胚层基因MAP2。第10代iPSC染色体核型正常,为46,XY,携带和患者相同的PIWIL2基因c.731＿732del AT纯合突变。【结论】SCOS患者的皮肤成纤维细胞可被重编程为iPSC,PIWIL2的功能缺失突变不影响这一过程。构建的iPSC和hESC形态相似,多次传代后染色体核型正常,并携带和患者相同的PIWIL2突变,具有多能性和分化的潜力,可用于体外向生殖细胞的诱导分化。第三部分PIWIL2的缺失对诱导多能干细胞向生殖细胞诱导分化的影响【目的】SCOS极有可能是原始生殖细胞（Primordial germ cell,PGC）或精原干细胞（Spermatogonial stem cell,SSC）阶段的生殖细胞存在异常,以至睾丸中没有生精细胞。为解决人生殖细胞获得和培养面临的伦理和技术问题,将患者iPSC体外诱导分化为PGC样细胞（PGC-like cell,PGCLC）和SSC样细胞（SSC-like cell,SSCLC）,利用该模型探索PIWIL2的功能缺失对人生殖细胞早期发育的影响,也进一步验证PIWIL2为SCOS的致病基因。【方法】为消除不同iPSC细胞系之间的差异,为携带PIWIL2功能缺失突变的患者iPSC提供阳性对照,利用CRISPR/Cas9在正常可育男性iPSC（对照组）中敲除PIWIL2（PIWIL2-/-组）,并将PIWIL2杂合敲除iPSC(PIWIL2+/-组)作为PIWIL2-/-组的对照,并检测以上各组和患者iPSC多能性基因表达、转座子LINE-1表达、细胞增殖和细胞周期。将4组iPSC在体外诱导分化为PGCLC,流式检测诱导2,4,6天的诱导效率,RT-qPCR检测诱导4天PGC相关基因BLIMP1,STELLA,TFAP2C和NANOS3,以及多能性基因OCT4,SOX2和NANOG的表达,免疫荧光标记CD38阳性的PGCLC,观察这些细胞的迁移能力以模拟胚胎时期PGC的迁移。在诱导体系中引入新的小分子化合物丙戊酸（Valproic acid,VPA）,优化iPSC向SSCLC的诱导体系,检测诱导过程中SSCLC比例的变化、细胞凋亡、SSC相关基因的表达,用不同干细胞系对优化后体系的可行性进行验证。用优化后的体系将4组iPSC在体外诱导分化为SSCLC,流式检测诱导8,10,12,14天的诱导效率,RT-qPCR检测诱导12天SSC相关基因PLZF,ID4,DMRT1和GFRα1,以及多能性基因OCT4,SOX2和NANOG的表达,免疫荧光标记各组诱导12天PLZF和GPR125的表达。【结果】（1）在正常可育男性iPSC中敲除PIWIL2,作为患者iPSC的阳性对照。对照组,PIWIL2-/-组,PIWIL2+/-组和患者组iPSC有多能性基因表达,细胞增殖、细胞周期和LINE-1表达基本在同一水平,PIWIL2的敲除不影响iPSC的基本特征。各组iPSC均可被诱导分化成PGCLC,各组诱导2天的PGCLC比例没有明显差异,诱导4天和6天时PIWIL2-/-组,PIWIL2+/-组和患者组PGCLC的比例较对照组降低,但PIWIL2-/-组和PIWIL2+/-组之间PGCLC的比例没有明显差异;诱导4天时,RT-qPCR显示PIWIL2-/-组,PIWIL2+/-组和患者组PGC相关基因表达较对照组下降,但PIWIL2-/-组和PIWIL2+/-组之间基因表达没有明显差异,各组多能性基因的表达水平也没有显著差异;各组PGCLC在贴壁培养后都可在培养皿中迁移。因此,患者的iPSC可被诱导成为PGCLC,PIWIL2的缺失对PGCLC的特化和迁移没有明显影响。（2）为优化干细胞体外向SSCLC的诱导分化体系,在SSCLC诱导体系中引入VPA后,较参考文献的含有维生素C（Vitamin C,VC）的诱导体系,可明显提升SSCLC的诱导效率,降低诱导过程中细胞死亡;含较低浓度VC和VPA的SSCLC诱导体系在SSCLC诱导第12天时可获得最高诱导效率,该体系诱导出的SSCLC表达多个SSC相关基因,并可将不同NOA患者iPSC诱导分化为SSCLC;该体系提高SSCLC诱导效率可能是通过改变组蛋白修饰;较高浓度的VPA可能还有提高诱导过程中单倍体细胞比例的作用。（3）用优化后的诱导体系可将4组iPSC诱导分化为SSCLC,在诱导8,10,12,14天,PIWIL2-/-组和患者组的SSCLC比例均低于对照组和PIWIL2+/-组,且这两组SSCLC的比例在10到14天不能平稳维持在一定水平;在诱导12天时,RT-qPCR和免疫荧光显示PIWIL2-/-组和患者组SSC相关基因的表达少于对照组和PIWIL2+/-组。虽然SCOS患者iPSC在体外可被诱导分化为SSCLC,但PIWIL2的缺失使得SSCLC的形成和维持能力降低。【结论】本研究优化了干细胞体外向SSCLC诱导分化体系,较低浓度的VC和VPA一起可有效促进不同来源干细胞向SSCLC诱导分化,获得较高比例的SSCLC,并表达多个SSC相关基因,优化后的SSCLC诱导体系可作为体外研究人SSC形成和发育、探索NOA未知病因和SSC关系的细胞模型。利用干细胞体外向生殖细胞诱导分化模型,发现PIWIL2的缺失不影响PGCLC的特化和迁移,但使得SSCLC的形成和维持能力降低,这一点和Mili（小鼠PIWIL2）敲除小鼠的SSC有自我更新和分化的异常有所不同。携带PIWIL2功能缺失突变的SCOS患者极有可能有SSC形成和维持的异常,作为出生后保证精子发生正常进行的关键细胞,SSC的逐渐丢失会造成精子发生的彻底失败,产生SCOS。本研究进一步验证了PIWIL2为SCOS的致病基因。第四部分PIWIL2的缺失影响精原干细胞样细胞形成和维持的机制探索【目的】第三部分的研究发现PIWIL2的功能缺失突变使得SSCLC的形成和维持能力降低。本部分探索PIWIL2的功能缺失导致体外SSCLC形成和维持异常的机制,为解释PIWIL2功能缺失在SCOS发病中的作用提供依据。【方法】流式检测对照组,PIWIL2-/-组,PIWIL2+/-组和患者组在SSCLC诱导第12天晚期凋亡细胞比例,RT-qPCR检测各组LINE-1的表达。构建含有SSC基因PLZF mRNA 3’UTR的EGFP报告质粒（UTR-EGFP）,转染至对照组和PIWIL2-/-组iPSC中,转染后24 h和48 h观察荧光,探索PIWIL2的缺失是否会直接影响PLZF mRNA的稳定性。将各组SSCLC诱导第12天的细胞消化后重新贴壁,免疫荧光检测PLZF和组蛋白H3K9ac,H3K27me3修饰,探索PLZF的表达是否受表观遗传的影响。对比对照组和PIWIL2-/-组iPSC以及诱导8天和12天细胞的转录组（RNA-seq）,GO和KEGG对差异基因进行富集,在对照组,PIWIL2-/-组,PIWIL2+/-组和患者组SSCLC诱导8天和12天的细胞中对差异基因进行验证。【结果】（1）PIWIL2-/-组和患者组SSCLC诱导第12天的细胞较对照组有更高的晚期凋亡细胞比例,这两组LINE-1表达也较对照组高,PIWIL2的缺失增加SSCLC诱导过程中细胞的凋亡,其抑制转座子的功能受损。（2）在对照组和PIWIL2-/-组iPSC中转染UTR-EGFP质粒,24 h和48 h观察荧光时未发现两组之间有明显差异,提示PIWIL2的功能缺失不直接影响SSC基因PLZF mRNA的稳定性。患者组和PIWIL2-/-组共定位的PLZF和H3K9ac荧光轻度均较弱,而H3K27me3荧光较强,PLZF的表达可能受到组蛋白修饰的影响。（3）RNA-seq数据分析结果显示iPSC向SSCLC分化涉及到WNT信号通路的激活和干细胞多能性基因表达的抑制,SSC相关基因的表达逐渐增加,参考人早期生殖细胞单细胞测序文献,认为本研究的iPSC体外向SSCLC诱导分化模型一定程度上模拟了人SSC的形成过程。PIWIL2-/-组iPSC在向SSCLC诱导过程中WNT信号通路减弱,干细胞多能性基因没有被明显抑制。RT-qPCR结果显示,在SSCLC诱导的第8天和12天,PIWIL2-/-组和患者组WNT信号通路基因的表达较对照组和PIWIL2+/-组降低,而多能性基因的表达升高,结合PIWIL2-/-组和患者组iPSC体外向SSCLC诱导分化情况,提示PIWIL2的功能缺失突变引起患者SSC形成和维持异常是由于WNT信号通路减弱和多能性基因未被抑制。【结论】在iPSC向SSCLC的分化过程中,WNT信号通路激活,干细胞多能性基因表达逐渐被抑制,SSC相关基因的表达上调,这一定程度上模拟了人SSC的形成过程。PIWIL2的功能缺失除了抑制转座子功能受损和影响组蛋白修饰以外,还影响了iPSC向SSCLC分化中WNT信号通路的激活和干细胞多能性基因表达的抑制,诱导过程中细胞凋亡增加,使得SSCLC难以形成和维持。PIWIL2可能通过激活WNT信号通路和抑制多能性基因,促进人SSC的形成和维持,其具体调控机制有待进一步研究。