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目的:观察细胞周期相关蛋白P16、Cyclin D1及CDK4在博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺纤维化过程中各期的表达变化,进一步探讨细胞周期调节通路P16/Cyclin D1—CDK4通路在肺纤维化发病中的作用及其机制。
方法:将108只小鼠按随机数字表法分为3组。分为正常对照组(Cont组)(气管内注入同体积生理盐水),博来霉素诱导肺纤维化组(BLM组)(气管内注射BLM3.5 mg—kg—1)及法舒地尔(fasudil,FAS)干预组(FAS组)(气管内注射BLM3.5 mg·kg—1及腹腔内注射FAS15mg·kg—1)。各组分别于第3、7、14和128天各处死8只小鼠,取肺组织做病理切片,用苏木精—伊红(HE)及MASSON染色观察小鼠肺组织的病理形态改变:TUNEL细胞凋亡原位检测BLM组与Cont组肺组织细胞凋亡水平;免疫组织化学及Western blot检测BLM组和Cont组肺组织P16、CyclinD1及CDK4蛋白的表达;并计算P16蛋白与凋亡指数AI的相关系数。Western blot检测FAS组CyclinD1及Rock—1蛋白的表达。
结果:(1)苏木精—伊红(HE)及MASSON染色示Cont组的小鼠肺组织病理学检查改变轻微,炎性细胞浸润少,肺泡炎性渗出少见,肺泡间隔无增厚,无成纤维细胞的增殖,没有明显的肺纤维化性改变。BLM组肺组织病理切片按时间顺序呈现由肺泡炎至纤维化动态改变,造模后3天,肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞有破坏,肺泡腔内有少许红细胞漏出,肺泡及肺间质中有炎性细胞的浸润;造模后7天,肺泡结构破坏萎陷,肺泡腔增大,炎性细胞浸润明显,间质细胞增加,肺间隔增宽、增厚;造模后14天,少数肺泡融合,出现小灶或多灶实变,肺间隔显著增宽;造模后28天,肺泡炎症轻微,肺组织结构破坏,部分肺泡塌陷融合,其间见炎性细胞浸润,并可见大量宽带状及片状胶原纤维,呈弥漫性肺纤维化,BLM组的肺泡炎和肺纤维化评分均高于Cont组,有统计学意义(P<0.05)。
(2)TUNEL细胞凋亡原位检测示BLM组与Cont组相比,肺泡上皮细胞凋亡指数呈进行性上升,第28天达到峰值。
(3)免疫组化示P16、Cyclin D1及CDK4蛋白表达主要位于肺泡上皮细胞的细胞核和细胞浆。BLM组小鼠肺组织P16,CDK4蛋白肺组织阳性细胞数量随时间增加而增多;Cyclin D1蛋白阳性细胞数量随时间增加而减少。与同时间点Cont组比较,BLM组P16,CDK4蛋白阳性细胞数量均增多;Cyclin D1蛋白3、7、14天阳性细胞数量多于同时间点Cont组,28天则明显少于同时间点Cont组。
(4)Western blot示Cont组小鼠各时间点P16,Cyclin D1,CDK4蛋白表达差异均无显著性意义。BLM组P16蛋白从7天起表达逐渐增加,P<0.05;CDK4蛋白表达随时间增加而逐渐增加,P<0.05;Cyclin D1蛋白表达随时间增加而逐渐减少,P<0.05,但14天与28天无显著性差异。与Cont组相比,14、28天肺组织P16蛋白表达增多,P<0.05;7、14、28天CDK4蛋白表达增多,P<0.05:3、7天Cyclin D1.蛋白表达增多,P<0.05;14、28天Cyclin D1蛋白表达减少,P<0.05。
(5)Western blot示与同时间点BLM组相比较,FAS组小鼠Rock—1蛋白表达随时间增加而减少,P<0.05,同时Cyclin D1的表达也随时间增加而减少,P<0.05,但仍高于同时间点Cont组。
(6)P16蛋白与AI相关系数表明P16蛋白表达与肺泡上皮细胞凋亡成正相关。
结论:在肺纤维化进程中肺泡上皮细胞进行性减少,凋亡指数明显升高,且有P16、CDK4蛋白的过表达及Cyclin D1蛋白的低表达,过表达的P16蛋白与肺泡上皮细胞凋亡成正相关。肺纤维化进程中P16—Cyclin D1/CDK4细胞周期通路异常可能参与并共同作用与肺泡上皮细胞,导致肺泡上皮细胞细胞周期进行异常,这也许是最终发生肺纤维化的重要因为。肺纤维化进程中Cyclin D1蛋白的低表达还可能与异常激活其他信号通路如RhoA/Rock信号传导通路相关。Rho/Rock信号转导通路可通过参与调节P16/Cyclin D1—CDK4通路对肺纤维化起促进作用。