高脂血症又称为血脂代谢紊乱或异常,是由脂质代谢紊乱引起的一种代谢性疾病,主要是指血浆或血清中的甘油三酯(TG)水平、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)升高和(或)高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)水平降低。近年来研究发现,高脂血症是动脉粥样硬化(AS)发生发展的主要危险因素,并与心血管疾病如冠心病、心肌梗死及肾脏疾病、胰岛素抵抗、脂肪肝的发病率与死亡率之间存在着明显的正相关。流行病学研究表明,随着我们国家经济的发展和人民生活水平的提高,高脂血症的发病率也呈逐年上升趋势。如果不能进行有效的干预,高脂血症及其相关疾病将会成为影响人类身体健康及生活质量的一个重要危险因素。花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)是生物体内一种含量丰富、分布极为广泛的多不饱和脂肪酸,是体内多种重要生物活性物质的前体。当刺激作用于细胞时,细胞膜磷脂在磷脂酶A2(Phospholipase A2, PLA2)的脂解作用下释放出花生四烯酸进入胞浆,花生四烯酸通过环氧化酶(COX)、脂氧化酶(LOX)及细胞色素P450表氧化酶(Cytochrome P450, CYP450)等三种酶途径进行代谢。细胞色素P450表氧化酶主要包括2C和2J两类,在人体内许多组织中均有表达。花生四烯酸在CYP450的作用下生成四种环氧-二十碳三烯酸(5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET和14,15-EET)。体内EETs在可溶性表氧化物水解酶(sEH)的作用下水解生成二羟基-20碳三烯酸(DHET)。CYP450-EETs在维持机体心血管稳态中发挥着重要作用。EETs具有扩张血管,降低血压的作用,其机制可能与激活Ca2+敏感的K+通道,引起血管平滑肌细胞超极化有关；EETs可以通过激活丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)信号通路,促进内皮细胞的增殖及新生血管形成：EET可以明显减轻TNF-α诱导的内皮细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路,增加抗凋亡蛋白BCL-2的表达有关；EET可以显著降低血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)的表达,且EET可以通过抑制核转录因子(NF-κB),抑制单核细胞对血管壁的黏附来发挥抗炎作用。此外,EETs不仅能明显促进肿瘤的迁移和侵袭生长,还在改善胰岛素抵抗、糖尿病肾病及肥胖等代谢性疾病中发挥着重要作用。在本实验研究中,我们假设CYP2J2基因过表达,使体内EETs的水平增加,从而增加了肝脏组织及血管的脂肪酸氧化,改善了高脂饮食诱导的小鼠高脂血症。因此,我们探讨了CYP2J2基因过表达对高脂饮食诱导的小鼠高脂血症的影响及其可能的分子机制,并在体外研究CYP2J2过表达或外源性加入EETs对肝细胞(HepG2、LO2)及内皮细胞(HUVECs)脂质代谢异常模型的影响及其可能涉及的分子机制,从而明确CYP2J2-EETs系统是否能够改善高脂饮食诱导的脂质代谢异常。一、体内实验CYP2J2基因过表达改善高脂饮食诱导的小鼠高脂血症的作用及其机制实验目的：探讨CYP2J2基因过表达改善高脂饮食诱导的小鼠高脂血症的作用及其可能涉及的分子机制。实验方法：1.高脂血症小鼠模型的建立：8周龄健康雄性内皮特异性CYP2J2过表达转基因(Tie2-CYP2J2-Tr)小鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只随机分为四组：普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT):n=10,野生型C57BL/6J小鼠,给予普通饮食喂养；普通饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(Normal Chow+Tie2-CYP2J2):n=10,内皮特异性CYP2J2过表达转基因(Tie2-CYP2J2-Tr)小鼠,给予普通饮食喂养；高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(HFD+WT):n=10,野生型C57BL/6J小鼠,给予高脂饮食喂养；高脂饮食+Tie2-CYP2J2.Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2):n=10,内皮特异性CYP2J2过表达转基因(Tie2-CYP2J2-Tr)小鼠,给予高脂饮食喂养。按上述实验分组分别给予普通饮食和高脂饮食喂养16周后,检测相应指标。2.实验中称取并记录各组小鼠体重,留取小鼠血标本离心后于-80℃保存：实验结束前留取各组小鼠24小时尿液标本,加入二甲胺离心后放置于-80℃冰箱备用。实验结束后用戊巴比妥麻醉(50mg/kg)并处死实验动物,留取血标本,同时留取各组小鼠肝脏、血管、心脏、主动脉、皮下及内脏脂肪、肾脏等标本在4%甲醛溶液中固定,于脱水机中脱水浸腊后,使用石蜡包埋机包埋组织后存放于室温备用(注：皮下脂肪和内脏脂肪于4%甲醛固定前称重)。3.检测各组小鼠血清及肝脏中甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、p-羟基丁酸的水平及血清中谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平；4.采用H&E及油红染色方法评估各组小鼠肝脏的形态学改变；5.采用GC-FID/MS检测血及肝脏中脂肪酸的水平；6.采用实时定量PCR检测小鼠肝脏及血管组织中PPARα及CPT-1的表达；7.Westrn blot方法检测各组小鼠肝脏及血管脂肪酸氧化相关蛋白p-AMPKα, p-ACC,CPT-1和PPARα的表达。实验结果：1.Western blot结果显示,普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT)和高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(HFD+WT)肝脏及血管组织中均无CYP2J2蛋白表达,普通饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)及高脂饮食+Tie2.CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)肝脏及血管组织中CYP2J2表达丰富(P<0.05),表明CYP2J2在Tie2-CYP2J2-Tr小鼠体内成功过表达。ELISA检测尿液14,15-DHET结果显示,普通饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(NormalChow+Tie2-CYP2J2)及高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)小鼠尿液中14,15-DHET的含量,均明显高于普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT)和高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT)尿液中14,15.DHET的含量(P<0.05),提示CYP2J2基因可成功代谢花生四烯酸为EETs并发挥其生物学作用。2.在普通饮食喂养下,野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠体重、内脏及皮下脂肪含量并无明显统计学差异(P>0.05)；高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组的体重、皮下及内脏脂肪含量明显高于普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(P<0.05),高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)小鼠体重、皮下及内脏脂肪含量较高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组明显降低(P<0.05)。3.高脂饮食可以显著增加野生型C57BL/6J小鼠血及肝脏组织中甘油三酯及胆固醇的含量(P<0.05)；高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)血及肝脏中甘油三酯的含量、肝脏中胆固醇的含量均明显低于高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(HFD+WT)(P<0.05)。虽然高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)血中胆固醇的含量有下降趋势,但无明显统计学差异(P>0.05)。这一结果表明CYP2J2基因过表达可以明显抑制高脂饮食诱导的血及肝脏中甘油三酯的增高。高脂饮食显著降低野生型C57BL/6J小鼠血及肝脏组织中p-羟基丁酸的含量(P<0.05),而高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)血浆及肝脏中β-羟基丁酸的含量明显高于高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(HFD+WT)(P<0.05)。然而,普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT)和普通饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)血及肝脏中甘油三酯、胆固醇及p-羟基丁酸的含量无明显统计学差异(P>0.05)。上述结果表明CYP2J2基因过表达显著改善高脂血症小鼠的脂质代谢异常。4.高脂饮食可以显著增加野生型C57BL/6J小鼠血浆中ALT及AST的含量(P<0.05),高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组ALT及AST的含量明显低于高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠(P<0.05)；不仅如此,肝脏H&E结果显示给予野生型C57BL/6小鼠高脂饮食喂养16周后,小鼠肝脏组织中脂质积聚情况较普通饮食喂养的C57BL/6小鼠明显增多(P<0.05)；给予Tie2-CYP2J2-Tr小鼠高脂喂养,其肝脏的脂质积聚情况较高脂饮食喂养的野生型小鼠明显减轻,且差异有统计学意义(P<0.05)；然而,普通饮食喂养条件下,C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的肝脏组织HE染色并无明显差异(P>0.05)。上述结果在各组小鼠肝脏组织的油红染色中更进一步得到证实。这些结果表明CYP2J2过表达可以明显降低肝脏组织中高脂饮食诱导的脂质积聚,从而改善了高脂血症小鼠的肝脏功能。5. GC-FID/MS结果反应了CYP2J2基因过表达后对小鼠血和肝脏组织脂肪酸含量的影响：高脂饮食可以显著增加野生型C57BL/6J小鼠血浆及肝脏组织中脂肪酸的含量(P<0.05),CYP2J2过表达可以显著抑制高脂饮食诱导的肝脏脂肪酸的升高(P<0.05),但其对血浆中脂肪酸的含量并无明显影响,即高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组与高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组血中脂肪酸的含量并无明显统计学差异(P>0.05)。同样,在普通饮食喂养下,野生型C57BL/6J小鼠和Tie2-CYP2J2-Tr小鼠的血浆及肝脏中脂肪酸的含量并无明显统计学差异(P>0.05)。6.实时定量PCR结果显示普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT)和普通饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)肝脏及血管组织CPT-1及PPARα的表达水平无明显差异(P>0.05)；高脂饮食可以显著降低野生型C57BL/6J小鼠肝脏及血管组织中CPT-1及PPARα的表达(P<0.05),高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)肝脏及血管组织CPT-1及PPARα的水平较高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(HFD+WT)明显升高M (P<0.05)。7. Western blot结果显示：普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT)和普通饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(Normal Chow+Tie2-CYP2J2)小鼠肝脏及血管组织中p-AMPKa, p-ACC, CPT-1及PPARa的表达水平无明显统计学差异(P>0.05)；高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(HFD+WT)小鼠肝脏及血管组织p-AMPKα, p-ACC, CPT-1及PPARa的表达较普通饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(Normal Chow+WT)明显降低(P<0.05),高脂饮食+Tie2-CYP2J2-Tr小鼠组(HFD+Tie2-CYP2J2)肝脏组织及血管中上述指标较高脂饮食+野生型C57BL/6J小鼠组(HFD+WT)明显增高(P<0.05),表明CYP2J2基因过表达显著逆转高脂饮食诱导的小鼠肝脏组织和血管脂肪酸氧化相关蛋白p-AMPKα, p-ACC, CPT-1及PPARa的降低。二、体外实验CYP2J2过表达及外源性EETs改善游离脂肪酸(FFA)诱导的HepG2、LO2及HUVECs脂质代谢异常的作用及其机制实验目的：探讨CYP2J2过表达及外源性EETs改善游离脂肪酸(FFA)诱导的HepG2、LO2及HUVECs脂质代谢异常的作用及其可能的分子机制。实验方法：1. HepG2、LO2细胞及HUVECs培养于含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基,于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养。待肝细胞(HepG2、LO2)及内皮细胞(HUVECs)生长到80%-90%汇合时消化并传代,当细胞生长至70%-80%汇合并经同步化处理后,进行后续实验。2.重组腺相关病毒介导的CYP2J2及GFP基因(rAAV-CYP2J2及rAAV-GFP)转染HepG2、LO2细胞及HUVECs,于荧光显微镜下观察确定转染成功后加入AMPKa抑制剂(Compound C).PPARa抑制剂(GW6471)及游离脂肪酸(FFA)处理24小时；3.经同步化处理的HepG2、LO2细胞及HUVECs,给予AMPKa抑制剂(Compound C)、PPARa抑制剂(GW64711)、14,15-EET抑制剂(14,15-EEZE)及14,15-EET, FFA共同孵育24小时；4.检测干预的HepG2、LO2细胞及HUVECs内甘油三酯的水平；5. Western blot方法检测干预的细胞p-AMPKα, p-ACC, CPT-1及PPARa的蛋白表达。实验结果：1.FFA诱导的HepG2、LO2细胞及HUVECs中甘油三酯的水平明显高于无处理的细胞(P<0.05)。FFA组与FFA+rAAV-GFP组相比甘油三酯水平无明显统计学差异(P>0.05),FFA+rAAV-CYP2J2组各细胞甘油三酯水平较FFA组明显降低, CompoundC及GW6471均能逆转rAAV-CYP2J2的降甘油三酯作用(P<0.05)。同样,FFA+14,15-EET组各细胞甘油三酯水平较FFA组显著降低,14,15-EEZE及GW6471均能逆转14,15-EET的降甘油三酯作用(P<0.05)。2. Western blot检测了HepG2、LO2细胞及HUVECs中脂肪酸氧化相关蛋白p-AMPKα, p-ACC及CPT-1的表达。结果显示与未干预细胞相比,FFA能显著降低HepG2、LO2细胞及HUVECs中p-AMPKα,p-ACC及CPT-1的蛋白表达(P<0.05),转染rAAV-CYP2J2干预FFA诱导的细胞,较单纯FFA干预可以明显增加p-AMPKa, p-ACC,CPT-1的蛋白表达,而这一效应可以在一定程度上被Compound C阻断(P<0.05),表明CYP2J2的降甘油三酯作用在一定程度上依赖于AMPKa/ACC/CPT-1信号通路。与上述结果相似,与单纯FFA干预相比,14,15-EET可以明显增加FFA干预的细胞p-AMPKα,p-ACC及CPT-1的蛋白表达,14,15-EEZE在一定程度上阻断了上述效应(P<0.05)。上述结果提示CYP2J2过表达或外源性给予14,15-EET可能通过增加脂肪酸p氧化相关蛋白的表达从而降低细胞甘油三酯的积聚。3. Western blot结果显示CYP2J2过表达能明显逆转FFA诱导的PPARa表达降低,而该效应在一定程度上被Compound C阻断(P<0.05),表明PPARa在一定程度上受AMPKa的调控。与未处理细胞相比,FFA诱导可降低细胞PPARa及CPT-1的表达,CYP2J2过表达或给予外源性14,15-EET可以明显逆转FFA诱导的PPARa及CPT-1表达的降低,该效应在一定程度上被GW6471阻断(P<0.05),该结果提示除AMPKa/ACC/CPT-1信号途径外,CYP2J2过表达或给予14,15-EET尚可通过PPARa/CPT-1增加脂肪酸p氧化,从而达到降低细胞内TG含量的作用。统计学分析应用SPSS17.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准误表示,组间差异采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结论1. CYP2J2过表达可以明显减轻高脂血症小鼠体重、皮下及内脏脂肪含量,显著改善高脂饮食喂养的小鼠高脂血症,减轻高脂血症引起的肝脏脂肪酸及脂质积聚,提示CYP2J2过表达具有改善高脂血症小鼠脂代谢异常的作用。2. CYP2J2过表达可以显著增加肝脏组织及血管脂肪酸β氧化相关蛋白p-AMPKα,p-ACC, CPT-1及PPARa的表达。3. CYP2J2过表达或外源性EETs均可通过激活AMPKa/ACC/CPT-1及PPARa/CPT-1信号通路,从而增加脂肪酸β氧化,最终改善细胞甘油三酯积聚；其中,PPARa在一定程度上受AMPKa的调控。4.CYP表氧化酶-EETs系统通过增加脂肪酸β氧化,从而降低血浆及肝脏中甘油三酯含量,减轻肝脏组织中脂质堆积,最终达到改善高脂饮食诱导的小鼠高脂血症的作用。5.本实验结果为高脂血症的防治及治疗提供了崭新的思路,为进一步研发新型调脂药物提供了可靠的理论指导。