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研究背景与目的：miRNAs (microRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的单链RNA。miRNAs通常情况下与靶mRNAs的3’非编码区序列(3’UTR)或5’UTR不完全互补结合,从而调控靶基因表达。近年来的研究表明,miRNAs通过调控原癌基因与抑癌基因的表达在肿瘤的发生与发展过程中发挥重要作用。CYP2J2是细胞色素P450表氧化酶家族中的一员,广泛存在于人体心血管系统、肺、肾脏及肝脏组织中。CYP2J2代谢花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)生成4种环氧-二十碳三烯酸(ex-poxyeicosatrienoic acid, EETs),分别为5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET。在心血管系统,EETs被认为是一种内皮源性超极化因子,促进内皮细胞增殖、迁移及类微血管结构形成,抑制血管平滑肌细胞迁移以及减轻炎症反应。CYP2J2与EETs在肿瘤生长及转移过程中也发挥重要作用。我们以前研究发现,CYP2J2在多种肿瘤细胞系中高表达,而在正常细胞系中表达水平相对较低；并且CYP2J2在多种癌组织中的表达明显高于癌旁组织。那么CYP2J2在癌组织和癌旁组织中的差异性表达是否与miRNAs的调控相关?miRNAs调控CYP2J2的作用机制是什么?目前这些问题尚未有答案。因此,本文研究了miRNAs对CYP2J2的调控作用,并探讨了其在肿瘤中的作用及机制。实验方法：1.利用生物信息学软件预测可能与CYP2J2的3’UTR结合的miRNAs,将CYP2J2的3’UTR克隆至荧光素酶报告基因载体(pMIR-Report载体)中。将miRNAs转染至细胞中,检测miRNAs对CYP2J23’UTR报告基因荧光素酶活性的影响,初步筛选可能与CYP2J2的3’UTR结合的miRNAs。将miRNAs在pMIR/CYP2J2-3’UTR上的可能结合位点突变,检测荧光素酶活性,确认miRNAs与CYP2J2的3’UTR结合进而抑制荧光素酶活性。2.在多种肿瘤细胞系中转染miRNAs,利用western blot验证miRNA对CYP2J2蛋白的影响；通过ELISA检测miRNA对CYP2J2代谢产物14,15-EET的影响；3.在肿瘤细胞中转染miRNA,检测其对细胞增殖、凋亡及CYP2J2相关信号通路的影响；4.在裸鼠移植瘤模型中,研究miRNA对肿瘤生长、转移及CYP2J2相关信号通路的影响；5.收集人的肿瘤组织标本,通过实时定量PCR及western blot分别检测癌组织及癌旁组织中的miRNA及CYP2J2表达水平,并分析二者之间的关系。实验结果：1.miRNAs的初步筛选及验证通过荧光素酶报告基因实验,我们发现let-7b显著抑制pMIR/CYP2J2-3’UTR报告基因荧光素酶活性,而miR-140促进荧光素酶基因表达。通过western blot证实let-7b显著抑制肿瘤细胞中CYP2J2蛋白表达,ELISA提示转染let-7b显著降低细胞培养基中CYP2J2代谢物14,15-EET浓度。2. let-7b通过下调CYP2J2抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡let-7b转染人乳腺癌细胞、舌鳞癌细胞、肺癌细胞及宫颈癌细胞中,EDU细胞增殖实验检测发现,let-7b抑制肿瘤细胞增殖,而Annexin V/PI流式检测表明let-7b明显促进肿瘤细胞凋亡；CYP2J2特异性的抑制剂(C26)能明显增强let-7b的肿瘤细胞生物效应,而CYP2J2的代谢产物14,15-EET明显抑制let-7b的肿瘤细胞生物效应；通过western blot检测发现,let-7b通过影响CYP2J2的相关信号通路(pAKT/AKT、 pERK/ERK及Bax)影响肿瘤细胞的增殖与凋亡。3. let-7b通过下调CYP2J2抑制肿瘤的生长及转移在裸鼠乳腺癌移植瘤模型中,过表达let-7b显著抑制肿瘤生长及转移。我们对相关机制进行研究发现,let-7b抑制肿瘤组织中CYP2J2及pAKT/AKT、pERK/ERK表达、促进凋亡基因Bax及肿瘤转移抑制基因nm-23的表达；同时每两周检测裸鼠24小时尿液中14,15-EET水平,发现let-7b显著降低14,15-EET水平。4. let-7b与CYP2J2在人肿瘤组织中的表达及二者之间联系检测人肺癌组织及癌旁组织中let-7b与CYP2J2的表达水平,结果发现let-7b在癌组织中的表达显著低于癌旁组织,而CYP2J2在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,并且let-7b与CYP2J2在人肿瘤组织中的表达呈现相反的关联。在人乳腺癌组织中,我们得到类似结果。5.miR-140调控CYP2J2基因表达通过荧光素酶报告基因实验及实时定量PCR,我们发现miR-140显著增加pMIR/CYP2J2-3’UTR报告基因荧光素酶活性及mRNA稳定性；我们通过western blot验证,miR-140增加CYP2J2蛋白表达。结论：1.本研究发现miRNAs在转录后水平调控CYP2J2表达：let-7b通过与CYP2J2的3’UTR结合抑制CYP2J2蛋白表达及其酶活性,而miR-140增加mRNA稳定性,促进CYP2J2蛋白表达。2.利用分子生物学及细胞生物学技术,对let-7b在体内、体外对肿瘤生长的作用及其机制进行了研究,我们发现：(1) let-7b通过调控CYP2J2,抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡；(2) let-7b通过调控CYP2J2,抑制裸鼠移植瘤的生长及转移；(3)let-7b在人肺癌及乳腺癌的癌组织中的表达显著低于癌旁组织,并与CYP2J2的表达成相反的关联。