低共熔溶剂修饰的磁性生物质纳米材料用于蛋白质的分离分析研究

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磁固相萃取技术(Magnetic solid phase extraction,MSPE)以磁性分离替代传统固相萃取的过滤离心等步骤,相对固相萃取而言更为便捷迅速,被广泛应用于样品的预处理方面。生物质材料是自然界中的天然产物,不同的生物质材料结构赋予其独特的物理化学性质,具有对生态环境友好、经济廉价的优点的生物质材料在样品分离分析方面的应用已多有报道。低共熔溶剂(Deep eutectic solvent,DES)是一种含有丰富氢键网络的“绿色溶剂”,它通过研磨或者混合加热较短时间即可得到,其组成成分对人体和环境基本低毒或无毒。DES具有较高的生物相容性、化学稳定性和功能可设计性。将DES、生物质材料和MSPE相结合,设计合成DES修饰的生物质磁性纳米材料,应用于磁固相萃取,将为生物质材料的应用及现代分离分析技术提供新的思路。本研究设计合成了三种不同的DES功能化的生物质磁性纳米颗粒,应用于胰蛋白酶和卵清蛋白的磁固相萃取分离分析。主要研究内容如下:(1)苄基三甲基氯化铵/三氟乙酰胺低共熔溶剂和β-环糊精修饰的磁珠应用于胰蛋白酶的磁固相萃取合成了由三氟乙酰胺和苄基三甲基氯化铵组成的环保型低共熔溶剂(DES-TB),将其共价修饰在磁性环糊精(MB-NH2@CD)上,所得磁珠(MB-NH2@CD@DES-TB)应用于胰蛋白酶的固相萃取。在最佳萃取条件下,MB-NH2@CD@DES-TB对胰蛋白酶的萃取容量为549.87 mg·g-1。MB-NH2@CD@DES-TB和胰蛋白酶之间的萃取吸附平衡关系符合Langmuir吸附平衡的特点。胰蛋白酶标准溶液中胰蛋白酶的绝对回收率为16.8%。经过十次循环再利用,MB-NH2@CD@DES-TB对胰蛋白酶的萃取容量仍然保持良好。该萃取方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.072 mg·m L-1和0.240 mg·m L-1。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(SDS-PAGE)结果表明,MB-NH2@CD@DES-TB可以从牛胰脏粗提物实际样品中萃取胰蛋白酶。本研究制备的MB-NH2@CD@DES-TB磁性纳米颗粒有望成为从实际复杂样品中萃取胰蛋白酶的优良固相萃取剂。(2)水合柠檬酸/氯化胆碱低共熔溶剂修饰的四氧化三铁-甲壳素纳米材料应用于胰蛋白酶的磁固相萃取以生物质材料甲壳素和一种天然低共熔溶剂(水合柠檬酸/氯化胆碱低共熔溶剂,NADES-CC)为原料制备了一种磁性纳米复合材料(Fe3O4-Chitin@NADES-CC),应用于胰蛋白酶的萃取。在最佳萃取条件下,Fe3O4-Chitin@NADES-CC对胰蛋白酶的萃取容量可达1082.67 mg·g-1。Fe3O4-Chitin@NADES-CC对五种常见蛋白质的萃取实验结果表明该复合材料对胰蛋白酶的选择性萃取能力优良,对胰蛋白酶的吸附机理与Langmuir吸附理论相符,为单分子层吸附。在7次重复利用后,Fe3O4-Chitin@NADES-CC对胰蛋白酶的萃取容量约为400.23 mg·g-1。该胰蛋白酶萃取方法的定量限和检出限分别为0.266 mg·m L-1和0.080 mg·m L-1。SDS-PAGE结果表明,Fe3O4-Chitin@NADES-CC可以从牛胰粗提物中萃取出牛胰蛋白酶。所拟方法表明,含生物质材料甲壳素的Fe3O4-Chitin@NADES-CC磁性纳米复合材料为复杂样品中胰蛋白酶的分离分析提供了一种新思路。(3)苹果酸/氯化胆碱低共熔溶剂修饰的四氧化三铁-壳聚糖纳米材料应用于卵清蛋白的磁固相萃取制备了一种表面修饰天然低共熔溶剂(苹果酸/氯化胆碱低共熔溶剂,NADES-MC)的四氧化三铁-壳聚糖(Fe3O4-Chitosan)纳米复合材料(Fe3O4-Chitosan@NADES-MC),应用于卵清蛋白的固相萃取。在优化条件下,萃取剂Fe3O4-Chitosan@NADES-MC对卵清蛋白的最高萃取容量为196.86 mg·g-1。Fe3O4-Chitosan@NADES-MC对五种常见蛋白的萃取实验充分证明了Fe3O4-Chitosan@NADES-MC对卵清蛋白的选择性萃取效果。通过吸附等温线模型的拟合,发现卵清蛋白和Fe3O4-Chitosan@NADES-MC之间的吸附呈单分子层吸附。该复合材料在重复利用5次后,对卵清蛋白的萃取容量基本保持在53.46mg·g-1。方法学研究实验结果表明该方法具有良好的稳定性、精密度、重复性,检出限和定量限分别为0.047 mg·m L-1和0.014 mg·m L-1。SDS-PAGE结果表明,应用该萃取方法可以从鸡蛋清实际样品中萃取卵清蛋白。本研究制备的Fe3O4-Chitosan@NADES-MC磁性纳米复合材料在卵清蛋白样品的预处理方面具有广阔的应用前景。
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