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目的:初步探讨肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)中乳酸(lactic acid,LA)对髓源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)代谢、免疫抑制功能及其他生物学行为的调控,为肿瘤的免疫逃逸治疗提供新的思路和策略。方法:(1)免疫磁珠分选肺癌移植瘤小鼠肿瘤组织来源的MDSCs和脾脏来源的MDSCs,利用实时定量PCR(real time quantitative PCR,qRT-PCR)和葡萄糖、乳酸检测试剂盒检测MDSCs的糖酵解活性。利用流式细胞术(FCM)和精氨酸酶(Arg-1)、一氧化氮(NO)检测试剂盒检测MDSCs的免疫抑制功能和免疫抑制效应分子的表达水平。(2)利用小鼠肺癌Lewis细胞培养上清(tumor cell conditioned medium,TCCM)模拟肿瘤微环境,检测TCCM对MDSCs糖酵解活性和免疫抑制功能的作用,并利用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)阻断MDSCs糖酵解后,再观察TCCM对MDSCs糖酵解活性和免疫抑制功能的调控作用。(3)为了确定肿瘤微环境中发挥作用的分子,免疫磁珠分选MDSCs,在培养体系中加入乳酸,利用qRT-PCR和葡萄糖、乳酸检测试剂盒检测MDSCs的糖酵解活性。利用FCM和精氨酸酶、一氧化氮检测试剂盒检测MDSCs的免疫抑制效应分子的表达水平,CFSE染色检测MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用,利用台盼蓝染色计数活细胞数目,利用FCM检测MDSCs的凋亡情况和表面分子CD40、CD80、CD86、MHC-II和F4/80的表达情况。(4)为了排除是因为乳酸加入培养体系后导致的酸性环境对结果的影响,采用盐酸调节培养液的pH至6.7,用pH 6.7的培养液培养MDSCs,检测MDSCs糖酵解关键酶的表达水平、葡萄糖摄取量,乳酸生成量、免疫抑制功能、细胞存活情况、凋亡情况及表面分子CD40、CD80、CD86、MHC-II、F4/80的表达情况。并在利用2-DG抑制MDSCs的糖酵解的情况下,检测乳酸对MDSCs糖酵解和免疫抑制功能的调控。(5)为了探究乳酸对MDSCs调控作用的机制,qRT-PCR检测乳酸处理MDSCs后细胞中单羧酸转运体(monocarboxylate transporter proteins,MCTs)的mRNA表达水平,Western blot检测MCTs蛋白水平的变化,同时为了分析乳酸作用的机制,利用Western blot检测PI3K/AKT/mTOR信号通路的改变情况和葡萄糖转运体(glucose transporter 1,GLUT1)蛋白水平的改变。结果:(1)肺癌移植瘤小鼠肿瘤组织中的MDSCs与脾脏中的MDSCs相比,糖酵解相关蛋白mRNA的表达水平明显增高(p<0.05),免疫抑制效应分子Arg-1、iNOS和ROS的表达水平也显著增高(p<0.05),提示相比于脾脏中的MDSCs,肿瘤微环境中的MDSCs具有更高的糖酵解活性和更强的免疫抑制功能,我们继而对其中的机制进行探究。(2)与未处理组相比,TCCM处理组中的MDSCs糖酵解关键酶和相关蛋白mRNA的表达水平明显增高(p<0.05),葡萄糖摄取量和乳酸生成量的明显升高(p<0.05),MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用增强,免疫抑制效应分子的分泌也明显增多(p<0.05),提示TCCM可以上调MDSCs的糖酵解和免疫抑制功能,与之前的结果一致。加入2-DG抑制MDSCs的糖酵解后,TCCM则无法增强MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用和免疫抑制效应分子的分泌,提示TCCM对MDSCs免疫抑制功能的调控可能是通过影响其糖酵解活性所致。(3)在MDSCs的体外培养体系中加入乳酸,其糖酵解关键酶和相关蛋白mRNA的表达水平明显增高(p<0.05),葡萄糖摄取量和乳酸生成量明显升高(p<0.05),MDSCs对CD4~+T细胞增殖的抑制作用增强,免疫抑制效应分子的分泌也显著增多(p<0.05),MDSCs存活细胞数增多(p<0.05),凋亡细胞比例减少(p<0.05),细胞表面分子CD40、CD80、CD86、MHC-II、F4/80的表达水平均降低(p<0.05)。而在pH 6.7的培养体系中,这些现象不复存在,提示肿瘤微环境中的乳酸能够调控MDSCs糖酵解、免疫抑制功能、存活、凋亡和成熟度,并且这种调控作用是乳酸本身而非其引起的酸性环境所导致。在MDSCs的体外培养体系中加入2-DG抑制MDSCs的糖酵解后再加入乳酸,上述MDSCs的各种生物学行为均不发生改变,提示乳酸对MDSCs的调控可能是通过影响其糖酵解活性实现的。(4)乳酸作用于MDSCs后,MCTs的mRNA和蛋白水平的表达水平均明显增高(p<0.05),PI3K蛋白表达水平增高,AKT的磷酸化和mTOR的磷酸化水平增强(p<0.05),GLUT1蛋白的表达水平也显著上升(p<0.05)。提示乳酸作用于MDSCs后,膜表面的乳酸转运体表达增加,细胞内PI3K/AKT/mTOR通路被激活,从而增加细胞膜表面葡萄糖转运体的表达,使更多的葡萄糖被转运至胞内,增强细胞的糖酵解活性。结论:(1)与脾脏中的MDSCs相比,肿瘤微环境中的MDSCs具有更高的糖酵解活性和更强的免疫抑制功能。(2)肿瘤微环境中的乳酸通过MCTs转运至MDSCs胞内后,激活PI3K/AKT/mTOR通路,增强GLUT1的表达上调MDSCs的糖酵解。(3)肿瘤微环境中的乳酸通过上调糖酵解活性继而增强MDSCs的免疫抑制功能。