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目的
艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是一种由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus,HIV)引起的以CD4+T细胞的渐进性下降为特征的免疫缺陷性疾病,多因合并各种机会性感染和肿瘤而死亡。目前无法彻底治愈,且无有效的疫苗,原因之一在于宿主免疫细胞在HIV-1致病过程中发挥的作用仍未清楚,其中树突状细胞(Dendritic cells,DC)的研究备受关注。DC是免疫系统中功能最强的一种抗原提呈细胞,是连接先天性免疫和获得性免疫的桥梁,HIV-1感染中DC启动免疫应答和传播病毒的“双刃剑”作用到底是利于机体免疫还是利于病毒播散还未研究清楚。传统定义的外周血DC分为2个亚群:一群为髓系来源的DC(myeloid DC,mDC);另一群为淋巴系来源的类浆细胞样DC(plasmacytoid DC,pDC),两者均是CD16阴性的DC。最近研究发现DC中存在一个新的亚群:CD16+DC,高表达Fc(gamma)RIII(CD16)。CD16+DC受抗原刺激后发育成熟,高表达MHC分子、共刺激分子(CD80、CD86、CD40)以及分泌TNF-α、IL-12等细胞因子,具有递呈抗原和刺激初始T细胞活化以及诱导适应性免疫应答的能力,在抗病毒感染和抗肿瘸免疫反应中发挥重要作用。目前国外关于CD16+DC这一新亚群的研究较少,在HIV-1感染者中研究更少。国外有关HIV-1感染者CD16+DC数量与功能变化的研究结果还不一致,而有关CDl6+DC的研究在国内还未见报道。
CD16+DC作为DC的一个新亚群在HIV-1感染中所发挥的作用目前尚不清楚,CD16+DC表型和功能变化可能影响其介导免疫反应的发生和疾病进展的控制。本研究拟对HIV-1慢性感染者CD16+DC的数量、活化成熟状态、细胞因子分泌能力以及具有播散病毒作用的CD205分子的表达情况进行系统研究,明确HIV-1慢性感染者CD16+DC表型与功能的变化,明确CD16+DC在HIV-1感染中的作用,为控制HIV-1的感染和传播提供思路。
方法
1、研究对象
HIV-1慢性感染者(chronic HIV-1 infection,CHI)18例,均来自中国医科大学附属第一医院红丝带门诊,感染途径为男男性接触,即HIV-1+MSMs。平均年龄31(20-50)岁。入选标准:未接受抗反转录病毒治疗,感染时间一年以上。
健康对照组(NC)13例,平均年龄29(24-45)岁,入选标准:血常规及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗体阴性,无免疫系统疾病。
本研究内容获得参加者的书面知情同意。
2、标本采集
用10毫升EDTA抗凝负压真空采血管采集研究对象外周静脉血,在6小时内进行试验。
3、密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)
按照人外周血单个核细胞提取操作规程进行实验,准备EDTA-抗凝全血10ml,在离心管中加入Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液14ml,沿管壁缓慢加入用PBS稀释后的抗凝全血30ml,离心400g,30min。吸取界面层的PBMC,移入另一试管中,加入5倍体积的PBS缓冲液,洗细胞2次。得到的细胞用含有10%DMSO的胎牛血清(FBS)冻存。
4、CD16+DC细胞比例、表面共刺激分子及表面受体的检测
复苏3×106PBMC,并平均分配至5个流式细胞管中。以Lin-FITC/HLA-DR-APC-CY7/CD16-PE-CY7定义CD16+DC;分别加入抗CD40、CD83、CD80、CD86、CXCR4、CCR5、CD205荧光抗体,混匀,4℃冰箱避光孵育30分钟。孵育结束后,每管加入2mlPBS,离心,弃上清重悬细胞,加入1%多聚甲醛的固定,应用LSR-II流式细胞仪进行检测,BD FACSDivaTM软件分析结果。
5、CD16+DC细胞因子分泌的检测
将复苏好的6×106PBMC放入12孔培养板中,分别用TLR4激动剂LPS和TLR8激动剂R848刺激细胞,同时加入GolgiPlug,设置未刺激对照孔。充分混匀后,将12孔培养板放入37℃、5%CO2培养箱中培养6小时。孵育结束后取5支流式管,将细胞和单克隆荧光抗体Lin-FITC/HLA-DR-APC-CY7/CD16-PE-CY7加入到相应各管中,混匀,4℃冰箱避光孵育30分钟。表面染色后,加入Cytofix/Cytoperm solution 4℃冰箱中破膜20分钟。破膜结束后,洗涤,各管加入胞内染料组合(TNF-α-PE/IL-6-APC、IL-12-PE/IL-10-APC)后充分混匀,4℃冰箱避光孵育30分钟。洗涤,1%多聚甲醛固定后应用LSRII流式细胞仪进行检测,BDFACSDivaTM软件分析结果。
6、CD4+T细胞绝对计数
将20μlBD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP试剂加入绝对计数管中,逆向加入50μl混匀的抗凝全血,室温避光染色15分钟,加入1×免洗溶血素450μl,室温避光溶血15分钟,应用FACS Calibur流式细胞仪及MuitiSET软件检测并分析得到CD4+T淋巴细胞的绝对值。
7、HIV-1病毒载量测定
取1mlEDTA抗凝血浆,采用Roche公司COBAS(R)AmpliPrep(R)/COBAS(R) TaqMan(R)System自动载量仪上以实时荧光定量PCR方法测定病毒载量。全部操作按照操作说明书进行。
8、统计学分析
应用SPSS18.0软件包进行统计分析,数据处理成中位数或均值±标准误,两组间实验指标的比较采用Mann-Whitney U检验,相关性分析采用Spearman秩相关检验,P＜0.05为有统计学意义。
结果
一、CD16+DC表型的变化研究:
1、HIV-1慢性感染者外周血CD16+DC百分比与健康对照的比较及其与CD4和HIV-1病毒载量(VL)的关系:
HIV-1慢性感染者CD16+DC百分比高于健康对照组(P=0.048),与CD4和病毒载量无相关性(P=0.880,P=0.760)。
2、HIV-1慢性感染者CD16+DC表面共刺激分子和受体与健康对照的比较:
HIV-1慢性感染者CD16+DC表达CD40和CD86的百分比高于健康对照组(P=0.014,P=0.022)。CD16+DC表达CD80和CD83的百分比与健康对照组相比,无统计学差异(P=0.806,P=0.315)。
HIV-1慢性感染者CD16+DC表达HIV-1辅助受体CXCR4和CCR5的百分比显著高于健康对照组(P=0.001,P＜0.001)。
HIV-1慢性感染者CD16+DC表达CD205的百分比高于健康对照组(P=0.012)。
3、HIV-1慢性感染者CD16+DC表面CD205的表达与CD4和病毒载量的关系:
HIV-1慢性感染者CD16+DC表面CD205的表达与HIV-1病毒载量显著正相关(r=0.602,p=0.008),与CD4无显著相关性,有负相关趋势(r=-0.412,p=0.089)。
二、CD16+DC功能的变化研究:
1、在TLR4激动剂LPS、TLR8的激动剂R848分别刺激作用下CD16+DC细胞因子TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10分泌水平的变化:
在TLR4激动剂LPS刺激作用下,HIV-1慢性感染者CD16+DC产生的TNF-α、IL-6低于健康对照组(P=0.018,P=0.003)。
在TLR8激动剂R848的刺激作用下,HIV-1慢性感染组CD16+DC产生的TNF-α、IL-6、IL-12低于健康对照组(P=0.025,P=0.014,P=0.034)。
在两种刺激下,HIV-1慢性感染组CD16+DC产生的IL-10的较健康对照组有上升趋势,但没有统计学差异。
2、TNF-α、IL-6、IL-12的分泌水平与病毒载量的相关关系:
在TLR4激动剂LPS刺激作用下,HIV-1慢性感染者CD16+DC产生的TNF-α、IL-6与病毒载量显著负相关(r=-0.717,P=0.001;r=-0.626,P=0.005),IL-12与病毒载量有负相关趋势,但没有统计学差异(r=0.437,P=0.07)。
在TLR8激动剂R848刺激作用下,HIV-1慢性感染者CD16+DC产生的TNF-α、IL-6与病毒载量显著负相关(r=-0.756,P＜0.001;r=-0.728,P=0.001),IL-12与病毒载量有负相关趋势,但没有统计学差异(r=-0.442,P=0.066)。
结论
1、HIV-1慢性感染者外周血CD16+DC数量增加,共刺激分子CD40和CD86的表达上调,提示HIV-1慢性感染者CD16+DC处于高活化状念:细胞因子分泌功能下降,与病毒载量显著负相关,提示CD16+DC可能不能有效地发挥抑制病毒复制和介导免疫应答的作用。
2、HIV-1慢性感染者外周血CD16+DC表达CXCR4和CCR5增加,凝集素受体CD205表达增加,与病毒载量正相关,提示CD16+DC对HIV-1易感性增加,具有传播HIV-1病毒的能力。