论文部分内容阅读
三阴性乳腺癌是指免疫组化ER阴性、PR阴性、HER-2阴性的特殊病理亚型,好发于绝经前青年女性,具有高复发风险,易发生内脏转移,对药物治疗反应差,预后凶险等特点。在许多肿瘤组织中有转录因子Nanog表达,其表达水平与肿瘤的复发、转移以及耐药有关。因此,在三阴性乳腺癌干细胞的研究中,检测和跟踪Nanog转录因子的表达及功能,可为此类疾病探索新的治疗方法提供理论依据及良好的实验和技术基础。本研究以三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为研究对象,通过无血清悬浮培养的方法,从中收集获得了悬浮微球体。通过流式细胞术对其细胞表面标志进行测定、紫杉醇对其生长的抑制实验及NOD/SCID小鼠皮下成瘤实验证明,此微球体为富集的乳腺癌干细胞。随后通过Real-time PCR、RT-PCR、Western Blot等方法,检测了 Nanog转录因子在MDA-MB-231乳腺癌干细胞中分子以及蛋白水平上的表达情况。以及通过慢病毒转染MDA-MB-231乳腺癌干细胞,检测了干扰和下调Nanog转录因子表达的情况。干扰实验设Nanog siRNA组(转染对Nanog基因有干扰作用的siRNA序列组)、阴性对照组(Negative siRNA组,转染对细胞无任何干扰作用的siRNA序列组)和空白对照组(Control组,不转染任何siRNA)。通过体内实验检测下调Nanog表达对MDA-MB-231乳腺癌干细胞的增殖、侵袭和对耐药性的影响。通过以上研究显示,在无血清培养基中,数量稀少的MDA-MB-231乳腺癌干细胞以悬浮微球体的形式存在并进行扩增,MDA-MB-231乳腺癌细胞CD44+/CD24-/low细胞亚群的比例(76.6%)低于MDA-MB-231乳腺癌干细胞(92.7%)(P<0.05)。紫杉醇可剂量依赖的降低MDA-MB-231细胞增殖,其半数抑制浓度(IC50)为(4.25±0.22)ug/ml,低于 MDA-MB-231 干细胞的(8.13±0.34)ug/ml(t=9.549,P<0.05)。接种0.2×106个乳腺癌干细胞的小鼠成瘤率100%(10/10),而同样接种MDA-MB-231乳腺癌细胞量的小鼠中只有60%(6/10)可形成肿瘤。MDA-MB-231干细胞组瘤体平均体积(1040±52.65)mm3大于MDA-MB-231 细胞组瘤体平均体积(558.4±32.72)mm3(t=7.763,P<0.05)。Real-time PCR、RT-PCR以及Western Blot检测结果显示,Nanog转录因子在MDA-MB-231干细胞的表达水平高于MDA-MB-231细胞,并具有显著性差异(P<0.05)。利用小分子RNA干扰片段可以下调MDA-MB-231干细胞Nanog的表达。下调Nanog蛋白的表达后,Nanog siRNA组成瘤率为80%、瘤体平均重量(0.73 ±0.0.04)g,平均体积均低于 Control 组和 Negative siRNA 组。Nanog siRNA 组紫杉醇 IC50(5.27±0.22)ug/ml 少于 control 和 Negative siRNA 组。注射浓度为16ug/ml的紫杉醇1ml,Nanog siRNA组的肿瘤体积和瘤重分别为(732.6± 19.23)mm3和(0.752±0.053)g,小于 Control 组和 Negative siRNA组(P<0.05)。Nanog siRNA 组生存时间长于 Control 组、Negative siRNA 组。移植瘤HE染色显示,Nanog siRNA组的肿瘤少。移植瘤组织Western印迹凝胶成像条带显示:与 Control 组、Negative siRNA 组比较,Nanog siRNA 组 Nanog 蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。本研究证明,MDA-MB-231乳腺癌干细胞可通过无血清悬浮培养法获得,Nanog与MDA-MB-231乳腺癌干细胞的致瘤性及化疗拮抗性相关,利用小分子RNA干扰片段下调Nanog的表达能抑制MDA-MB-231乳腺癌干细胞NOD/SCID小鼠移植瘤生长,降低对化疗药物紫杉醇的耐药性,Nanog可能是乳腺癌的基因靶向治疗的一个潜在作用靶点,为乳腺癌治疗提供了新的方向和思路。