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三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）是一类侵袭性强、预后差的恶性肿瘤。然而,由于其对分子靶向治疗和内分泌治疗不敏感,以蒽环类药物为主的化疗仍然是TNBC的主要治疗方法。为了减轻化疗毒副作用对机体的损伤,膳食补充被建议使用作为新的辅助化疗方案,其潜在的分子机制尚未完全阐明。因此,寻求安全有效、易于获得、副作用小的辅助化疗药物是三阴性乳腺癌的治疗趋势。壳寡糖（chitosan oligosaccharides,COS）是一种膳食补充剂,已被大量实验证实能有效抑制肿瘤细胞的增殖。但现有体外实验研究普遍采用的较高剂量,未能充分认识COS的抗肿瘤作用。因此,有必要探究低浓度COS及其与化疗药阿霉素（doxorubicin,DOX）的联合给药对三阴性乳腺癌细胞模型的干预,以及是否对阿霉素的抑癌效果产生影响。实验在高转移特性的三阴性乳腺癌典型细胞株MDA-MB-231上评价了COS与阿霉素联用的抗肿瘤活性,进而采用转录组学测序技术（RNA-seq）挖掘分析其潜在分子靶点。主要研究工作及结果如下:（1）COS组分表征。采用液相色谱-质谱联用法对本实验采用的COS进行表征,结果表明:COS聚合度为2～4。（2）COS抑制细胞增殖的活性评价。采用CCK-8法对COS单独给药和联合阿霉素给药进行细胞水平活性评估。结果表明:低浓度COS（0～1000μg/m L）单独作用无细胞毒性。而COS短时预孵后联用阿霉素(IC50浓度),可剂量依赖性增强阿霉素原有的半数抑制效应（p<0.001）。优化的预孵时间为4 h。比较不同聚合度的COS单体抑癌效果,壳三糖具有良好的剂量依赖性,且最低抑制浓度仅6.25μM,与阳性对照DOX组相比,细胞生存率降低了16.49%（p<0.001）。而壳三糖浓度为100μM时,细胞生存率达最低19.44%±1.91。由此确定联合给药最佳方案为壳三糖（4 h,100μM）+阿霉素（2.5μg/m L）。（3）通过小室迁移实验测定COS、壳三糖单独作用均可明显抑制细胞迁移。通过倒置显微镜观测到COS、壳三糖短时预孵均引发MDA-MB-231细胞由间充质向上皮样转化现象,冷场扫描电镜观测到细胞表面微绒毛变短、成簇。通过激光共聚焦和流式细胞术测定COS、壳三糖短时预孵后联用DOX可显著促进阿霉素进入细胞核（p<0.001）,且chitotriose+DOX组平均荧光强度比COS+DOX组显著增加（p<0.01）。由此说明,COS和壳三糖具有促进阿霉素快速富集于MDA-MB-231细胞核的作用,且壳三糖协同抑制效果优于COS。（4）RNA-seq分析靶基因。分组采用优化条件下的chitotriose+DOX为联用组,培养基组为空白对照,DOX组为阳性对照,以及壳三糖单独作用1,2,4 h为时间序列。时间序列的差异基因聚类热图分析显示,壳三糖作用4 h过程内,在2 h时已呈现明显差异表达模式,说明2 h可能是差异基因表达的关键节点。KEGG分析表明,与空白组相比,壳三糖预孵4 h的差异基因主要富集于Pathways in cancer、Human papillomavirus infection、PI3K-Akt、Focal adhesion、Breast cancer等途径,进一步对5个主要富集途径的差异基因进行分析,最显著的差异基因为TMEM61、MYC、GADD45A、FOS、JUN、CDKN1A、RASGRP1、FGL2、COLQ、BMP4、EFNA4、EFNA1和FRAT1。Venn图展示了壳三糖在联用中的靶基因范围,通过424个靶基因的蛋白互作预测,定位网络中最关键调控因子为EGR1。（5）靶基因功能验证。采用qRT-PCR法验证上述靶基因表达情况,chitotriose 4 h组TMEM61、MYC、GADD45A、FOS、JUN、CDKN1A、RASGRP1的mRNA水平显著上调（p<0.001）,FGL2、COLQ、BMP4、EFNA4、EFNA1、FRAT1的mRNA水平显著下调（p<0.001）。其中差异倍数最大的是TMEM61（上调12.62倍）和FGL2（下调11.36倍）,表明对壳三糖预孵调控的关键作用。采用小干扰RNA（siRNA）法沉默关键基因EGR1表达,检测到相关基因GADD45A在转录和蛋白水平也随之下降;同时细胞生存率实验证明,沉默EGR1基因表达弱化了壳三糖协同阿霉素抑制细胞活性的效应,表明壳三糖引起的EGR1上调是联合给药的关键调控基因。综上所述,壳三糖短时预孵通过上调表达EGR1而促进阿霉素抑制MDA-MB-231细胞增殖的活性。