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TMS1(target of methylation-induced silencing1甲基化诱导静止基因)是1999年Masumoto[1]在研究细胞分子形态学改变与细胞凋亡关系时发现的一种抑癌基因,包含PYD和CARD两种蛋白结构,此两种蛋白在细胞凋亡及免疫调节过程中扮演着重要角色,所以TMS1也很可能具有这两种功能。TMS1为CpG岛相关性基因,其启动子甲基化会导致基因沉默,研究发现TMS1蛋白在部分肿瘤细胞中由于高度甲基化同时伴随DNMTs的增多而表达沉默,致使细胞凋亡调控机制紊乱,肿瘤过度增长,严重影响了肿瘤病人的预后。As203作为临床重要的抗肿瘤药物,其去甲基化能力及机制尚不明确。本试验选用As203作为去甲基化实验药物,选取已经被证实有去甲基化作用的药物地西他滨(Decitabine, DCA)作为对照,对慢性髓系白血病细胞株K562细胞TMS1基因进行去甲基化作用,探讨TMS1基因在K562细胞中甲基化模式改变的机制及其与白血病发病的关系,同时为完善As203在白血病治疗中发挥作用机制提供理论与实验证据,进一步拓宽恶性血液病治疗策略上的新思路。本课题研究主要包括3个方面：1、TMS1在K562细胞及正常骨髓对照中表达的研究：选取6例正常人及非恶性血液病患者骨髓细胞作为骨髓细胞对照组,采用RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)检测TMS1在K562细胞及正常骨髓对照中的表达；采用MSP(甲基化特异性PCR)法检测K562细胞中TMS1基因甲基化程度。结果表明,正常人及非恶性血液病患者骨髓细胞中均可检测到TMS1mRNA表达,而K562细胞中未扩增出TMS1mRNA产物；MSP检测显示TMS1基因在K562细胞中呈完全甲基化,提示TMS1基因甲基化可能是其沉默表达的重要原因,而且这种缺失可能在白血病的发生发展过程中扮演重要的角色。2、TMS1基因甲基化在K562细胞中的表达分析及As203对其去甲基化作用：采用MSP法检测不同浓度As203处理后K562细胞TMS1甲基化程度,RT-PCR及Western Blot检测TMS1蛋白表达；Western Blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达水平；细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V/PI)标记、流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明：K562细胞中TMS1mRNA及蛋白呈低表达状态,分别为(0.01±0.01)、(0.09±0.02)；2μmol/L AS2O3可完全逆转K562细胞TMS1的甲基化水平,TMS1mRNA及蛋白表达分别为0.72±0.04和1.3±0.06(P<0.01),与处理前相比明显升高；细胞凋亡检测结果显示,与对照组相比,2μmol/L AS2O3处理组细胞凋亡率明显增加(2.05±0.16对12.24±1.06,P<0.05)。与对照组相比,2μmol/L AS2O3处理组K562细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达明显增高,Bcl-2/Bax比值明显降低(1.94±0.14对0.56±0.12,P<0.01)。3、K562细胞TMS1基因去甲基化后NF-κB表达的变化：体外培养K562细胞,设空白对照组、0.5μmol/L DC A实验组、1μmol/L DC A实验组。采用MSP检测各组K562细胞TMS1基因甲基化程度；RT-PCR及Western blot检测各组K562细胞TMS1基因与NF-κB在mRNA及蛋白水平表达变化；CCK-8法检测K562细胞增殖抑制作用,光学显微镜下观察细胞形态变化。结果表明TMS1基因去甲基化后NF-κB的表达下调,与空白对照组相比,实验组TMS1mRNA及蛋白表达均增高,而NF-κB表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度的DCA对K562细胞均有一定的增殖抑制作用,且呈量效和时效关系。结论：1、TMS1基因在K562细胞中呈完全甲基化并沉默表达。2、As203可通过逆转抑癌基因TMS1的甲基化状态,恢复其表达,并通过下调Bcl-2/Bax比值促进K562细胞凋亡。3、TMS1基因甲基化沉默表达可能会异常激活NF-κB途径,部分参与白血病的发生