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糖蛋白的Mucin型O-糖链具有重要的生物学功能,并且其异常表达与多种疾病如肿瘤的发生发展密切相关,因此,对正常和病理条件下细胞的Mucin型O-糖链进行系统性的定性定量分析具有重要的生物学意义。但是,Mucin型O-糖链结构复杂多样,在生物体内表达具有微量性和微不均一性,并且由于缺少糖链的扩增表达技术,系统性比较分析正常和肿瘤细胞中Mucin型O-糖链的差异仍存在挑战。本研究基于寡糖代谢工程,对正常和肿瘤细胞系中Mucin型O-糖链进行扩增表达,质谱技术(MS,MS/MS)结合内标法定量,以及稳定同位素标记相对定性定量分析策略,对不同细胞系中Mucin型O-糖链进行定性定量比较分析,以研究正常和肿瘤细胞系中Mucin型O-糖链表达的差异;同时对所得的带有苄基的Mucin型O-糖链直接通过在线亲水作用色谱-电喷雾电离质谱联用(HILIC-MS)技术进行进一步分离分析,以解析正常和肿瘤细胞系中Mucin型O-糖链的精细结构。结果如下:1.采用内标法相对定量分析肿瘤细胞系(HeLa,SMMC-7721,HepG2和MCF-7)和正常细胞系(L02)中表达的Mucin型O-糖链,四种肿瘤细胞系HeLa,SMMC-7721,HepG2和MCF-7中分别检测到19、11、6和5条Mucin型O-糖链;正常细胞系L02中检测到10条Mucin型O-糖链。研究发现,结构组成为N1,H1N1A1,H1N1A2的糖链在五种细胞系中均有表达;肿瘤细胞系表达的Mucin型O-糖链的种类比正常细胞多,且O-糖链的岩藻糖基化和唾液酸化程度均高于正常细胞组。在肿瘤细胞系中特有的O-糖链主要有岩藻糖化和唾液酸化修饰的Mucin型Core 2结构糖链;MS/MS分析表明,其中的岩藻糖基化修饰O-糖链结构组成为H3N3F1A2,H4N4F1A2和H5N5F1A1,唾液酸化修饰的O-糖链结构组成为H5N4A1,H4N4A2和H5N5A2(H:己糖;N:N-乙酰氨基己糖;A:唾液酸;F:岩藻糖)。2.在寡糖代谢工程的基础上,建立了基于稳定同位素碘甲烷/氘代碘甲烷(CH3I/CD3I)衍生Mucin型O-糖链的质谱相对定量分析新方法,平行进行定性定量分析,提高O-糖链相对定量方法的准确性。对建立的相对定量方法从线性、重复性、稳定性等方面进行了考察。结果表明,此相对定量方法有着良好的相性关系(R2=0.998)和重现性(CV≤5%)。并将该方法成功应用于人正常肝细胞(L02)和人肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2的O-糖链表达差异分析中。结果显示,SMMC-7721和L02中的Mucin型O-糖链分别为16和9条;且SMMC-7721中O-糖链的岩藻糖基化和唾液酸化程度均高于L02,如结构组成为H1N1A1,H1N2A1,H2N2A1,H2N2A2的O-糖链表达量为L02中的1.1、10.17、2.0、1.7倍;HepG2和L02细胞系的相对定量比较中,HepG2检测到6条O-糖链,少于L02组;但是其O-糖链的表达量均高于L02细胞组,如糖结构组成为N1,H1N1、H1N1A1,H1N1A2的O-糖链,表达量为L02组的4.79、5.45、1.14、1.84倍,且唾液酸化水平高于正常组。3.通过在线HILIC-MS和MS/MS分析,对基于寡糖代谢工程得到的SMMC-7721、HepG2、L02细胞中的Mucin型O-糖链进行检测分析,分别检测到14,5,9条O-糖链,该结果与ESI-MS检测结果基本对应;并且通过HILIC-MS在SMMC-7721细胞系中新检测出H1N2结构糖链,在L02细胞系中新检测出N2结构的糖链;但是,这三种细胞系中表达的Mucin型O-糖链在该液质联用检测模式下,均未鉴定出同分异构体糖链。