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宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中居第二位,在发展中国家居首位,目前国内外研究发现宫颈癌的发生及发展与宫颈局部免疫微环境有着密切的关系,研究表明部分CIN和宫颈癌患者病灶中出现CTL细胞及Treg细胞,而且Treg细胞参与宫颈病变的抗免疫反应,同时发现当CTL细胞表面的PD-1及CTLA-4过度表达时,又会使CTL细胞处于“免疫无能”状态,导致免疫失调,肿瘤进展,目前肿瘤的免疫治疗备受关注,莪术油是中国的传统中药,其主要成分为莪术挥发油。已有学者发现,莪术油对卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞有明显的抑制作用,但在宫颈癌方面的研究报道较少,本课题第一部分从细胞、分子水平探讨莪术油对宫颈局部免疫微环境的调控,第二部分通过检测莪术油栓治疗前及治疗后宫颈病变组织中的Ki67,P16,P53蛋白表达情况,来判断莪术油栓的治疗CIN的效果。探讨莪术油抗病毒,抗肿瘤的机制,为临床应用莪术油提供了理论基础。第一部分莪术油对宫颈SiHa-Treg-CTL体系免疫微环境的调控目的:以siHa宫颈癌细胞上清液、CTL、Treg淋巴细胞共培养体系作为研究对象,观察莪术油在Treg影响下对CTL细胞的CTLA-4、PD-1的蛋白表达的影响,探讨莪术油对宫颈局部免疫微环境的作用。方法:1.免疫磁珠法分离人外周血CD8+T细胞,流式细胞术检测分选后细胞的纯度;免疫磁珠法分离人外周血CD4+CD25+Treg细胞;流式细胞术检测分选后细胞的纯度;2.流式细胞术检测SiHa(宫颈癌细胞)培养液对CD8+T细胞,Treg细胞比例的影响;3.CCK8法测定各浓度莪术油对CTL细胞增殖的影响;4.应用western-Blot检测并比较CTL正常培养组(对照组)、CTL+75%SiHa上清培养组(癌上清组)、CTL+Treg共培养组(Treg组)、CTL+Treg+75%SiHa上清培养组(癌上清+Treg组)、CTL+Treg+75%siHa上清+1ug/ml莪术油醇提水沉液组(癌上清+Treg+莪术油组),共五组SiHa-CTL-Treg培养体系中CTLA-4、PD-1的蛋白表达情况。结果:1.免疫磁珠法分离人外周血CD8+T及CD4+CD25+T细胞,经流式细胞术检测 CD8+T 纯度为 89.37 土 0.83%,CD4+CD25+T 细胞纯度为 82.12 士 2.17%。2.不同浓度siHa细胞培养上清液作用于CD8+T细胞,与空白血清对照组比较,75%培养上清组有统计学差异(P<0.05);而作用于Treg细胞时,50%培养上清组和75%培养上清组与对照组比较,有统计学差异(P<0.05),故选择75%Siha上清液作为下面实验的浓度。3.1ug/ml、1.5ug/ml、2ug/ml的莪术油醇提水沉液均可促进CTL增殖,选择效果最好的lug/ml做为后续实验的药物浓度。4.经Western-Blot检测并测定电泳条带灰度值,CTL与Treg共培养组,CTL细胞CTLA-4、PD-1的蛋白表达量明显增加,莪术油干预后CTLA-4、PD-1的蛋白表达量显著降低,说明莪术油可以抑制Treg对CTL中CTLA-4、PD-1蛋白的上调作用。结论:莪术油可以降低CTLA-4、PD-1的蛋白表达,从而改变局部免疫微环境而达到抑制肿瘤的作用。第二部分莪术油对CIN组织中Ki67,P16,P53蛋白表达的影响目的:通过检测莪术油栓治疗前及治疗后Ki67,P16,P53蛋白在CIN中的表达,分析莪术油的药理作用机制。方法:选取河北联合大学附属医院2011年1月～2013年1月收治的CIN患者,年龄30岁～40岁,组织学诊断为CIN,入组患者CIN I患者行Leep术,CIN II患者及CINIII患者行冷刀锥切术,(均为切缘不净,要求保留子宫及生育功能,拒绝补充二次手术),其中CIN I患者33例,CINII患者33例,CINIII患者34例,免疫组化检测Ki67,P16,P53蛋白在宫颈组织中的表达情况,术后第7天补充莪术油栓1.74g/粒,每晚1粒置于宫颈处,(月经期停用),连续用药3个月,阴道镜下宫颈组织取活检,再次作病理免疫组化检测Ki67,P16,P53蛋白表达,与用药前进行检测的Ki67,P16,P53蛋白表达的比较.结果:不同组别CIN患者莪术油治疗后p16蛋白阳性表达率较莪术油治疗前降低。差异均具有统计学意义。p53、ki67蛋白阳性表达,除CINI组治疗前后比较差异无统计学意义外,CINII、CINIII组患者莪术油治疗后两种蛋白的阳性表达率均低于治疗前,差异均具有统计学意义。结论:莪术油治疗CIN患者后能够有效降低p16、p53、ki67蛋白阳性表达率。莪术油对CIN有一定的治疗作用。