本课题组前期以小鼠卵巢裂解物为样品拉取NLRP2蛋白复合体,通过SDS-PAGE凝胶电泳,再银染切下差异条带送质谱分析,从中选取了四个可能与NLRP2相互作用的蛋白,通过Co-immunoprecipitation（Co-IP）和免疫印迹技术进行交互验证发现MYH11和RPS3与NLRP2可能存在相互作用关系。本论文分别成功构建了Nlrp2、Myh11和Rps3表达载体并两两转染至293T细胞中,结合免疫共沉淀和免疫印迹进一步验证NLRP2和候选互作蛋白在生理状态下是否存在相互作用关系,之后通过荧光定量PCR、免疫组化、免疫印迹、免疫荧光以及RNA干扰等技术研究NLRP2相互作用蛋白在早期胚胎发育过程中的功能。结果:设计Nlp2、Myh11和Rps3的引物,从小鼠卵巢中提RNA,通过cDNA的合成和RT-PCR扩增编码Nlrp2、Myh11和Rps3的CDs区。之后将编码上述基因的CDs区和骨架载体进行双酶切,通过片段纯化、连接、转化、摇菌、质粒小提、酶切鉴定和重组质粒的测序分别构建Nlrp2、Myh11和Rps3真核表达载体并利用去内毒素的试剂盒进行质粒大提。为了鉴定重组质粒能否表达出相应蛋白,分别将质粒转染至293T细胞中并通过Western blot（WB）鉴定,结果显示重组质粒可以表达出相应蛋白。为了研究NLRP2是否在生理状态下与MYH11和RPS3存在相互作用关系,我们将重组质粒两两（NLRP2和MYH11、NLRP2和RPS3）共转染到293T细胞中,体外培养48h裂解转染细胞,利用Co-IP和WB进行交互验证,结果显示:利用NLRP2抗体拉取的免疫复合体,用MYH11抗体进行WB验证没有检测出MYH11蛋白条带;而利用MYH11抗体拉取的免疫复合体,用NLRP2抗体进行WB验证也没有出现NLRP2蛋白条带,证明NLRP2和MYH11蛋白之间不存在相互作用。利用NLRP2拉取的免疫复合体,用RPS3抗体孵育,能够检测出RPS3蛋白条带,位置正确,分子量大小为27KDa;利用RPS3拉取的免疫复合体,用NLRP2抗体进行WB验证,在120KDa左右出现蛋白条带,分子量大小与NLRP2蛋白相同,说明NLRP2和RPS3蛋白在生理作用下存在相互作用关系。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜显示NLRP2与RPS3蛋白在小鼠卵母细胞和早期胚胎发育中定位相同,进一步证明了 NLRP2和RPS3是相互作用蛋白。结果表明RPS3蛋白在包括小鼠卵巢在内的多种组织中表达,在卵巢中RPS3蛋白主要存在于小鼠不同时期卵泡里的卵母细胞和颗粒细胞。排卵和受精以后,Rps3转录物及其编码的蛋白在卵母细胞和早期胚胎中均能检测到表达。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜揭示RPS3蛋白主要定位在小鼠卵母细胞和早期胚胎胞质中。利用RNA干扰技术进一步研究Rps3在小鼠早期胚胎发育过程中的功能,结果表明在合子中沉默Rps3将导致早期胚胎发育阻滞。结论:本论文成功构建了Nlrp2、Myh11和Rps3真核表达载体,并证实NLRP2和RPS3蛋白在生理状态下存在相互作用关系,在合子中沉默Rps3将导致早期胚胎发育阻滞,该研究进一步揭示了 NLRP2蛋白复合体的功能,为哺乳动物早期胚胎发育机制的阐明奠定基础。