目的乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。乳腺癌细胞的转移潜力密切依赖于肿瘤微环境,肿瘤微环境是由癌细胞、免疫细胞、癌相关成纤维细胞、细胞外基质等组成。其中癌相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中的组成成分之一,在促进肿瘤转移和诱导化疗耐药中发挥重要作用。此外,我们实验室之前的研究结果表明,miR-21在CAFs中过量表达,揭示miR-21异常表达可能与CAFs的形成与功能发挥密切相关。本论文主要探讨miR-21及miR-21小分子抑制剂——AC1MMYR2(AMR)在CAFs诱导的肿瘤转移和紫杉醇化疗耐药过程中的作用及分子机制。方法1、利用原位杂交和免疫组化检测60对浸润性乳腺原位癌及转移癌中miR-21,FAP-α和α-SMA的表达水平,研究此三种蛋白的表达量和肿瘤转移之间的相关性。2、以乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7为模型,在以下几种条件下培养:标准培养基培养、CAFs条件培养基(CAF-CM)、加入AMR处理CAFs细胞24h后的条件培养基(AMR-CAF-CM)、加入紫杉醇、同时加入AMR-CAF-CM和紫杉醇;显微镜明场拍照观察细胞形态变化;Transwell和Wound Healing Assay检测细胞侵袭和迁移能力;Western Bloting或免疫荧光检测β-catenin、Vimentin、NF-κB等蛋白表达水平;Real-time PCR检测细胞中miR-21表达水平;免疫共沉淀检测细胞中β-catenin和NF-κB的相互作用关系;MTT法检测细胞在药物处理后的细胞半数致死量(IC50)。3、构建MDA-MB-231裸鼠乳腺癌原位模型。转染luciferase慢病毒的MDA-MB-231和CAFs以1:3注射到裸鼠乳腺脂肪垫上,建立乳腺癌裸鼠原位模型,体内研究AMR对CAFs诱导的肿瘤转移的影响。小鼠被随机分为六组(每组8只):PBS、taxol、CAFs、CAFs-taxol、AMR-CAFs、AMR-CAFs+taxol。小动物活体成像技术检测肿瘤大小和肺转移的荧光信号;H&E染色鉴定是否发生肺转移;免疫组化检测FAP-α,α-SMA,NF-κB,β-catenin和VHL的表达情况;免疫荧光检测冰冻切片组织中α-SMA和Cytokeratin的蛋白表达水平。结果第一,主要研究了癌相关成纤维细胞(CAFs)对乳腺癌转移和紫杉醇耐药性的作用。CAFs的标志性蛋白为FAP-α和α-SMA,本论文中针对60组浸润性乳腺原位癌及转移癌的病人样本进行检测,发现FAP-α、α-SMA以及miR-21的高表达与淋巴结转移正相关。进而为后续实验提供CAFs和正常组织的成纤维细胞(NFs),我们分离并原代培养CAFs和NFs,发现原代培养的CAFs细胞中高表达FAP-α、α-SMA和间质标记蛋白Vimentin,而不表达表皮标记蛋白E-cadherin和Cytokeratin,说明本论文中原代培养的CAFs保留了此类细胞的特性,能够用于后续实验。之后,将乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231经CAFs条件培养基(CAF-CM)或者NFs细胞条件培养基(NF-CM)培养,与NFs组相比,CAFs能够使乳腺癌细胞伸出微小伪足样胞质突起,形态上由具有极性的上皮细胞改变为纤维状的间质细胞,细胞的侵袭和转移能力显著增强;同时CAF-CM培养的乳腺癌细胞其上皮细胞-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)相关蛋白β-catenin、ZEB1、ZEB2表达水平显著升高,说明CAFs能够促进乳腺癌细胞发生EMT,从而加速转移。最后,MCF-7和MDA-MB-231的紫杉醇的半数最大抑制浓度(IC50)分别是0.1μM和0.4μM,经CFA-CM处理后IC50值增加了8-10倍,说明CAFs提高了乳腺癌细胞对紫杉醇的耐受性。综合以上结果说明,在乳腺癌病人样本中CAFs细胞与癌症淋巴结转移正相关,同时在细胞水平证明了,CAFs能够诱导乳腺癌细胞的转移和对紫杉醇的化疗耐药。第二,主要研究miR-21在CAFs诱导乳腺癌细胞转移中的作用。RT-PCR方法证明了,经CAF-CM处理,MCF-7和MDA-MB-231的miR-21表达水平分别增加了1.8和2.4倍,证明CAFs能够诱导癌症细胞表达miR-21。此外,采用转染miR-21 mimics的NFs培养以上两种乳腺癌细胞,细胞侵袭、转移能力增强、细胞形态由上皮向间质细胞转变、EMT相关β-catenin和Vimentin的表达水平升高;AMR-CAF-CM处理可降低CAFs中miR-21的表达,并且能够有效逆转CAFs诱导的乳腺癌细胞侵袭和转移,减少β-catenin和Vimentin表达,达到正常成纤维细胞与肿瘤细胞共培养的效果。以上结果说明,miR-21在CAFs的高表达是其促进乳腺癌细胞EMT以及转移的关键因素。第三,主要研究miR-21抑制剂——AMR对CAFs诱导乳腺癌细胞转移和紫杉醇耐受性的作用及其分子机制。AMR-CAF-CM处理能够降低CAFs诱导的MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的转移和侵袭能力。其次,紫杉醇能够抑制乳腺癌细胞的转移和侵袭,但是在CAF-CM处理乳腺癌细胞时,紫杉醇无法对癌细胞转移和侵袭发挥促进作用。而在AMR-CAF-CM处理乳腺癌细胞时,同时加入紫杉醇,可以下调β-catenin、ZEB1、ZEB2的表达,上调E-cadherin的表达,减少β-catenin核转位,即抑制细胞发生EMT。以上结果说明,AMR重塑CAFs,抑制CAFs诱导的乳腺癌转移并提高乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。进一步实验,对CAFs促进乳腺癌细胞由内皮向间质细胞转变过程的机制进行研究,结果发现:AMR-CAF-CM处理MCF-7和MDA-MB-231时,能够抑制miR-21的表达,促进miR-21的靶基因VHL的表达,导致NF-κB表达降低,减少NF-κB和β-catenin的共沉淀,抑制肿瘤细胞的转移,增强紫杉醇的化疗效果。说明AMR可以通过miR-21/VHL/NF-κB抑制CAFs诱导乳腺癌细胞的转移和增强紫杉醇化疗效果。第四,在小鼠体内验证AMR的作用。生物发光成像显示紫杉醇可以在一定程度上抑制肿瘤的生长,在CAFs处理组紫杉醇药效降低,而AMR联合紫杉醇可以显著抑制肿瘤生长。此外,H&E染色实验表明CAFs能够促进癌症细胞的肺转移,产生广泛的肿瘤灶,联合治疗组能够抑制肺转移。此外免疫组化实验表明AMR能使CAFs细胞中FAP-α,α-SMA的表达水平显著降低,使乳腺癌细胞中VHL的表达水平升高,β-catenin、NF-κB的表达水平降低。该体内实验的结果再次验证了细胞实验的结论。结论本论文证明了CAFs能够促进乳腺癌细胞的侵袭、转移、EMT和对紫杉醇的化疗耐药,并且发现miR-21是维持CAFs对乳腺癌细胞作用的关键因素。采用miR-21的小分子抑制剂——AC1MMYR2能够抑制CAFs对癌症细胞侵袭和转移的促进作用并增强癌细胞对紫杉醇的化疗敏感性,其分子机制为AC1MMYR2抑制CAFs细胞中miR-21的表达,重塑CAFs细胞,进而降低乳腺癌细胞中miR-21的表达,并靶向VHL抑制NF-κB信号通路的激活以及NF-κB和β-catenin的相互结合,从而阻碍癌细胞发生EMT。该研究为今后AMR用于临床肿瘤治疗奠定了理论及实验基础。