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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状的传染病,又称猪蓝耳病。PRRS已成为当前困扰中国养猪业健康发展的主要烈性传染病之一。本课题旨在从河北省本地猪场分离毒株,通过与Genbank上发表的核苷酸和氨基酸序列进行对比,了解河北PRRSV的分子流行病学特点。以本地分离株为基础,克隆表达编码PRRS病毒粒子中含量最多、免疫原性最强蛋白的ORF7基因,构建成熟的原核表达系统,并将表达的N蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。本研究从河北省多地送检的疑似PRRS阳性病料进行RT-PCR鉴定,将确诊的阳性病料接种Marc-145细胞,然后连续传代。其中河北新乐市送检病料接种Marc-145细胞后经过5代盲传后,出现典型细胞病变(CPE),初步分离到一株病毒,暂命名为PRRSV HB-XL株。进一步对其ORF5与NSP2基因克隆测序,经同源性比较及系统进化树等分析,表明该毒株ORF5与NSP2基因与国内流行的缺失变异株遗传关系较近,与国内外经典美洲型毒株及基因重组毒株QYYZ遗传关系较远且与欧洲型LV毒株处于不同分支;ORF5基因编码的200个氨基酸的第13位、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),第137位为具有野毒特性的丝氨酸(S);与经典美洲株相比,该毒株NSP2基因分别发生3个碱基和87个碱基的不连续缺失。说明HB-XL株属于美洲型PRRSV并存在不断变异的趋势。设计1对添加酶切位点的特异性引物扩增PRRSV HB-XL株的ORF7全基因,并与原核表达载体p ET-32a连接,构建ORF7基因的原核表达系统p ET-32a-N;将重组质粒转化入BL21感受态细胞,经IPTG的诱导表达,SDS-PAGE可检测到分子质量约为34.0k Da的目的蛋白;经Western-blotting分析,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性;并对表达条件进行了优化,结果表明在诱导时间为4h,IPTG浓度1.5m M,诱导温度为37℃的条件下目的蛋白表达量最大。将表达纯化后的N蛋白作为包被抗原,按一定的稀释度倍比稀释。采集PRRSV阳性猪血清,按一定稀释度倍比稀释。测定各步骤反应的条件,成功建立ELISA方法。重组抗原包被浓度为2.23μg/ml,37℃1h或者4℃过夜;封闭液为2%的明胶,37℃封闭1 h;血清1:80稀释,37℃作用1h;酶标二抗1:1000稀释,37℃作用40min;底物(TMB)室温显色15min;若检测的OD450>0.363则为阳性,若检测的OD450<0.34则为阴性。该方法与商业化的美国IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒的符合率为91.6%,其中相对敏感性为92.3%,相对特异性为90.4%,结果无显著差异。说明本研究建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性,有很好的临床应用前景。