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背景：以免疫效应细胞为基础的过继免疫治疗（AIT）是肿瘤生物治疗的重要方法之一，从实验室到临床都显现出了一定的抗肿瘤作用，日益受到人们的重视。然而对于大多数肿瘤来说，AIT并未取得满意的治疗效果，在临床上只起辅助治疗作用。嵌合抗原受体（CAR）基因修饰T细胞是近年来发展的靶向免疫治疗新策略，它赋予T细胞更强的增殖性，持久的生命力，靶向杀伤活性，使T细胞能克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，为肿瘤过继免疫治疗注入了新的活力。表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）是脑胶质瘤等恶性肿瘤中表达率很高的肿瘤特异性抗原，与肿瘤的发生、发展有密切关系，为肿瘤靶向治疗理想的分子靶点。本课题设计第二代嵌合抗原受体EGFRvⅢ scFv-CD137-CD3ζ，利用EGFRvⅢ scFv实现肿瘤抗原靶向性，共刺激分子CD137增强T细胞活性，CD3ζ激活T细胞毒性反应。以慢病毒介导CAR修饰T细胞，重定向T细胞特异性识别表达EGFRvⅢ的脑胶质瘤细胞，体内外试验证实其选择性杀伤作用，为胶质瘤等恶性肿瘤的免疫治疗探索新方法。目的：探讨嵌合EGFRvⅢ scFv-CD137-CD3ζ修饰T细胞对EGFRvⅢ阳性胶质瘤细胞的靶向杀伤作用。方法：利用基因合成方法获得Hinge-TM-CD137-CD3ζ，应用分子克隆技术将其克隆入慢病毒转移载体pCDH-CMV-MCS的EcoRI和BamHI位点，新获得的载体命名pCDH-CD137-CD3ζ。用PCR扩增pCR2.1TOPO-EGFRvⅢ scFv中的EGFRvⅢ scFv基因序列，将其克隆入pCDH-CD137-CD3ζ的EcoRI位点，基因连接方向的确定用菌落PCR鉴定。最后经DNA测序鉴定，新质粒命名为pCDH-CAR。通过磷酸钙沉淀法将包装质粒pDel8.9、包膜蛋白质粒pVSVG和含目的基因的转移质粒pCDH-CAR共转染293T包装细胞，收集病毒上清。用蔗糖超速离心沉淀法浓缩，制备成慢病毒（LV-EGFRvⅢ/CAR），用p24ELISA试剂盒测定病毒滴度。应用免疫磁珠技术分离、激活人外周血CD3+T淋巴细胞并用慢病毒感染，用流式细胞仪和Western blot检测CAR在T细胞的表达，51Cr释放法检测CAR+T细胞的选择性杀伤作用，ELISA法检测细胞因子IFN-γ的分泌。并在裸鼠体内验证其对人脑胶质瘤细胞株EGFRvⅢ+U87的肿瘤抑制作用。结果：DNA测序鉴定嵌合抗原受体各基因片段EGFRvⅢ scFv、铰链区、跨膜区、CD137胞内段和CD3ζ序列和连接正确，制备的慢病毒LV-EGFRvⅢ/CAR滴度达1.8x106TU/ml，转染T细胞的效率68.73%，体外试验显示CAR+T细胞对EGFRvⅢ+U87胶质瘤细胞的抗原依赖性激活和特异性的杀伤作用，共培养上清中检测到显著的IFN-γ活性，动物实验显示出CAR+T细胞对裸鼠移植肿瘤的特异性肿瘤抑制作用。结论：CAR+T细胞在体内和体外均显示出较好的肿瘤抗原特异性杀伤作用，为靶向性肿瘤过继免疫治疗奠定了一定的实验基础。