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类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种自身免疫性疾病,主要表现为关节的慢性滑膜炎症,在我国有较高患病率和致残率,是威胁健康的重要疾病之一。目前RA的病因尚不清楚,患者关节部位受到炎症持续侵蚀,导致多关节畸形,病情呈进展趋势且不可逆转,常伴关节外器官损伤,导致死亡率增加。而现有的治疗手段主要以延缓病变进程为主,无法将其彻底治愈。主要的治疗药物有较多的不良反应且价格昂贵,给长期用药带来了困难。身痛逐瘀汤治疗本病疗效确切且副作用低,经过灵活化裁可应用于RA各期各型的治疗,现广泛应用于RA的临床的治疗中。因其治疗机制尚未明了,故本研究拟观察身痛逐瘀汤对胶原诱导型关节炎(Collagen induced arthritis,CIA)大鼠的治疗作用和对RA成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)的影响,并基于p38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路探索其可能的作用机制。第一部分身痛逐瘀汤对CIA大鼠的治疗作用目的:观察身痛逐瘀汤对CIA大鼠的治疗作用,验证其在体内对RA炎症和关节滑膜的影响。方法:SD大鼠24只,6只作为对照组,其余大鼠构建CIA模型,造模成功后随机分成3组:模型组、p38抑制剂(SB203580)组、身痛逐瘀汤组。进行药物干预,连续28天。观察大鼠的一般情况和关节肿胀情况,并对关节症状进行评分。末次给药24h后取腹主动脉血检测CRP、RF、TNF-α、IL-1β的含量,取踝关节进行HE染色观察病理学变化并评分。结果:1.与对照组相比,模型组大鼠造模7 d后开始出现RA症状,活跃度减低,体重增长缓慢。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠RA症状较轻,活跃度稍高,体重增加较快,P<0.05;2.与对照组相比,模型组大鼠关节肿胀指数、关节炎指数升高。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠关节肿胀指数及关节炎指数降低,其峰值也降低,P<0.05;3.与对照组相比,模型组大鼠血清CRP、RF、TNF-α、IL-1β含量升高。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠血清上述血清标志物均降低,P<0.01;4.与对照组相比,模型组大鼠踝关节滑膜增生和炎症细胞浸润明显。与模型组相比,p38抑制剂组、身痛逐瘀汤组大鼠踝关节上述变化显著改善,关节病理评分降低,P<0.05。小结:身痛逐瘀汤能改善CIA大鼠关节炎症状和血清指标,抑制关节炎症和滑膜增生。第二部分身痛逐瘀汤对大鼠RA-FLS的影响目的:观察身痛逐瘀汤对大鼠RA-FLS增殖、侵袭及凋亡的影响。方法:分离培养正常大鼠FLS和CIA大鼠FLS(RA-FLS)。进行预实验确定p38抑制剂(SB203580)、PPARγ激动剂(GW1929)、身痛逐瘀汤含药血清的干预浓度及干预时间,用于正式试验。正常FLS设为对照组,RA-FLS设为模型组、p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组,分别进行药物干预。培养48h后,用流式细胞术检测各组细胞周期变化;CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖能力;Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1.与对照组相比,模型组S期细胞比例显著增加,G1期细胞比例显著减少,P<0.01。与模型组相比,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组S期细胞比例减少,G1期细胞比例增加,P<0.01;2.与对照组相比,模型组细胞增殖能力明显增强,P<0.01。与模型组相比,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组细胞增殖能力均减弱,P<0.01;3.与对照组相比,模型组穿模细胞数明显增多,细胞侵袭能力增强,P<0.01。与模型组比较,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组穿模细胞数均减少,细胞侵袭能力被抑制,P<0.01。4.与对照组相比,模型组细胞凋亡率显著减少,P<0.01。与模型组相比,p38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组细胞凋亡率均升高,P<0.01。小结:身痛逐瘀汤能抑制RA-FLS的异常增殖、侵袭,并诱导其凋亡。第三部分身痛逐瘀汤调控RA-FLS的机制研究目的:探索身痛逐瘀汤调控RA-FLS增殖、侵袭及凋亡的作用机制。方法:细胞分离和培养、细胞分组、药物干预同第二部分。Real-time PCR检测各组细胞中p38MAPK、PPARγ、CTGF、Cyclin-D1、caspase-3mRNA的表达;Western Blot检测各组细胞中p38MAPK、p-p38MAPK、PPARγ、CTGF、Cyclin-D1、cleaved-caspase-3蛋白的表达。结果:1.各组总p38MAPK mRNA及蛋白表达无差异。与对照组相比,模型组p-p38MAPK蛋白、CTGF mRNA及蛋白表达增多,PPARγmRNA及蛋白表达减少,P<0.01。与模型组相比,P38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组p-p38MAPK蛋白、CTGF mRNA及蛋白表达均降低,PPARγmRNA及蛋白表达均升高,P<0.05。2.与对照组相比,模型组Cyclin-D1 mRNA及蛋白表达增多,P<0.01。与模型组相比,P38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组Cyclin-D1 mRNA及蛋白表达均降低,P<0.05。3.与对照组相比,模型组caspase-3 mRNA及cleaved-caspase-3蛋白表达减少,P<0.01。与模型组相比,P38抑制剂组、PPARγ激动剂组、身痛逐瘀汤组caspase-3 mRNA及cleaved-caspase-3蛋白表达均升高,P<0.05。小结:1.p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路异常激活,刺激Cyclin-D1高表达,抑制cleaved-caspase-3表达,可能是RA-FLS增殖、侵袭能力增强,凋亡能力减弱的分子机制。2.身痛逐瘀汤能抑制p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路活性,下调Cyclin-D1表达,上调cleaved-caspase-3表达。3.身痛逐瘀汤能抑制RA-FLS增殖及侵袭,诱导RA-FLS凋亡,其作用机制可能与身痛逐瘀汤对p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路的调控密切相关。结论:身痛逐瘀汤能改善CIA大鼠关节炎症状和血清指标,减轻关节炎症及滑膜增生,可能与其抑制RA-FLS异常增殖及侵袭,诱导其凋亡相关。作用机制可能与身痛逐瘀汤对p38MAPK/PPARγ/CTGF信号通路的调控密切相关。